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.2011年2月25日；34(2):201-12.
doi:10.1016/j.immuni.2011.017.17。 Epub 2011年2月17日。

激酶MEKK2和MEKK3调节转化生长因子-β介导的辅助性T细胞分化

兴昌 1, 刘芳, 王晓芳, 林爱萍, 赵红玉, 苏冰冰（Bing Su）
附属公司

激酶MEKK2和MEKK3调节转化生长因子-β介导的辅助性T细胞分化

兴昌等。 免疫. .

摘要

有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是T细胞受体（TCR）信号的关键介质，但其在T辅助细胞（Th）分化中的作用尚不清楚。在这里，我们发现MAPK激酶激酶MEKK2（由Map3k2编码）和MEKK3（由Map3G3编码）负调控转化生长因子-β（TGF-β）介导的Th细胞分化。Map3k2（-/-）Map3k3（Lck-Cre/-）小鼠在外周表现出调节性T（Treg）和Th17细胞的异常聚集，这与体外TGF-β刺激后Map3k2[-/-]Map3k3[Lck-Cree/-）原始CD4[+）T细胞分化为Treg和Th17的频率高于野生型（WT）细胞一致。此外，Map3k2（-/-）Map3k3（Lck-Cre/-）小鼠发生了更严重的实验性自身免疫性脑脊髓炎。Map3k2（-/-）Map3k3（Lck-Cre/-）T细胞在其连接区的SMAD2和SMAD3蛋白磷酸化受损，从而负调控T细胞中的TGF-β反应。因此，TCR诱导的MAPK和TGF-β信号通路之间的串扰在调节Th细胞分化中很重要。

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数字

图1
图1。损失地图3k2和地图3k3在T细胞中导致Treg和Th17细胞的积聚体内
（A） 野生型脾细胞（WT）和地图3k2-/-地图3k3Lck-Cre公司/-对（dKO）小鼠进行CD4、CD8、CD44和CD62L染色，并用流式细胞仪进行分析。CD4的百分比+和CD8+上部面板显示T细胞。门控CD4+进一步分析T细胞的CD44+和CD62L+亚群体（下部面板）。配置文件中的数字表示门控人口的百分比。（B） 对脾细胞进行CD4和Foxp3染色，以显示Foxp3的百分比（门控盒中的数字）+CD4细胞+WT和dKO小鼠脾脏中的T细胞（Treg）。显示的数据来自门控脾CD4+细胞。FSC，正向散射。（C） 脾脏Foxp3概述+CD4细胞+WT中的T细胞（n=8），dKO（n=5），地图3k3Lck-Cre公司/-（3-cKO）（n=6），以及地图3k2-/-（2-KO）小鼠（n=6）。误差条显示标准偏差。**，双尾学生的p<0.01t吨测试。（D） 用PMA+离子霉素刺激离体脾细胞6小时，然后分析IL-17A和IFN-γ表达的CD4+流式细胞术检测T细胞。显示的数据在CD4上进行了门控+脾细胞和IL-17A和IFN-γ表达CD4的百分比+象限中显示了WT和dKO小鼠的T细胞。（E） 脾脏Th17小结+CD4细胞+WT（n=10）、dKO（n=8）、3-cKO（n=6）和2-KO小鼠（n=6）中的T细胞。误差条显示标准偏差。**，双尾学生的p<0.01t吨测试。（F、G）抹布1-/-小鼠用来自B6.SJL的混合骨髓细胞（CD45.1+)和dKO（CD45.2+)小鼠，或来自混合B6.SJL（CD45.1+)和WT（CD45.2+)老鼠的比例大约为1:1。8周后对受体小鼠的脾细胞总数进行CD4分析+Foxp3系列+细胞F）或CD4+白介素-17A+电池（G），如图所示。显示的数据在CD4上进行门控+CD45.1型+（B6.SJL）或CD4+CD45.2型+（WT或dKO）种群。门控区旁边的数字显示了门控种群的百分比，结果代表了来自两个独立实验的6对小鼠。
图2
图2。MEKK2和MEKK3抑制TGF-β介导的T细胞分化在体外
（A） 天真的CD4+T细胞（CD4+CD62L型你好CD44细胞洛CD25型-)来自WT和地图3k2-/-地图3k3Lck-Cre公司/-（dKO）小鼠分化为Foxp3+显示TGF-β浓度的Treg细胞。Foxp3的归纳+分化后5天进行细胞分析。当指示时，在整个培养物中添加TGFβ抗体（α-TGFβ）（5 ug/ml）。（B） 天真dKO CD4+T细胞（CD45.2+)或WT B6.SJL CD4+T细胞（CD45.1+)以1:1的比例单独或在混合培养中分化为Treg细胞，无需外源性TGF-β。分化Foxp3的频率+来自dKO和B6.SJL CD4的细胞+五天后测定T细胞。（C） 天真的CD4+将来自WT或dKO小鼠的T细胞分化为Th17细胞，并显示TGF-β和20 ng/ml IL-6的浓度。第五天，用PMA+离子霉素清洗分化细胞，并用IL17A重新刺激4小时+和Foxp3+流式细胞术检测细胞数。（D） 天真的CD4+WT或dKO小鼠的T细胞经10 ng/ml IL-12和TGF-β指示浓度的诱导分化为Th1细胞。第五天，干扰素-γ+和IL-17A+如图C（A-D）所示，通过流式细胞术测定细胞。图中的数字表示门控人群的百分比。数据代表三个（A、C和D）或两个（B）独立实验。
图3
图3。TGF-β信号转导的抑制地图3k2-/-地图3k3Lck-Cre公司/-小鼠减少外周Treg和Th17细胞
（A）地图3k2-/-地图3k3Lck-Cre公司/-（dKO）小鼠每隔一天用TGFβRI抑制剂SB431542或DMSO治疗一次，共治疗10天。Foxp3+CD4细胞+测定治疗前（第0天）和治疗后10天（第10天）dKO小鼠外周血中的T细胞。选通框旁边的数字显示选通人口的百分比。数据是三个独立实验的代表。（B） Foxp3概述+细胞占总CD4的百分比+3对野生型（WT）和dKO小鼠经SB431542或DMSO处理前后外周血T细胞的变化。图中的每个符号表示一个单独的鼠标。用SB431542或DMSO处理的dKO小鼠的（C，D）脾CD4 T细胞，分析Foxp3的频率+人口（C）或IL17A+流式细胞术检测人群（D）。选通框旁边的数字显示了选通种群的百分比。数据是来自两个独立实验的每组五只小鼠的代表性数据。
图4
图4。MEKK2和MEKK3介导R-SMAD连接子磷酸化并抑制SMAD转录活性
（A） 复合年增长率12-将Luc质粒核导入WT或dKO CD4+T细胞。核感染后4小时，用带有或不带有TGF-β的抗CD3+抗CD28抗体刺激细胞。16小时后测定荧光素酶活性，并将其归一化为非TGF-β刺激细胞的活性。（B） SMAD2和SMAD3中已知磷酸化位点的图示。MH1和MH2:MAD同源域1和2；连接子：连接MH1和MH2域的序列。（C） WT或dKO CD4+如图所示，用10 ng/ml TGF-β刺激T细胞，并在C末端进行SMAD3磷酸化（Ser423/425)免疫印迹法测定。ERK2液位用作装载控制。（D） WT或dKO CD4+在指定的时间段内，用抗CD3+抗CD28抗体（抗CD3+28）刺激T细胞。SMAD2-Ser处SMAD2和SMAD3连接区的磷酸化245+250+255，SMAD3系列204，SMAD2苏氨酸220和SMAD3 Thr179免疫印迹法测定。通过免疫印迹法测定总SMAD2和SMAD3蛋白水平。Actin级别显示为加载控件。（E） 用PMA+离子霉素（PMA+Ion）刺激WT和dKO CD4 T细胞，持续指定的时间。通过免疫印迹法测定SMAD2连接区和总SMAD2蛋白的磷酸化。（F） SMAD3表达载体与空表达载体（Ctl）或地图3k2（KK2）或地图3k3（KK3）注入293T电池。转染后24小时，测定连接区SMAD3的磷酸化。如图所示，通过免疫印迹法测定相同转染中ERK1和2的活化以及SMAD3、MEKK2和MEKK3的表达。（G） 复合年增长率12-将Luc报告质粒与空表达载体（Ctl）或地图3k2或地图3k3转染后24小时，用指定浓度的TGF-β再刺激细胞12小时。用双荧光素酶试剂盒测定报告活性。未经TGF-β刺激的报告活性被任意设置为值1，并用于归一化相对报告活性。（A-G）所示数据代表三个独立实验。（A）和（G）中的误差条显示标准偏差。**，双尾学生的p<0.01t吨测试。
图5
图5。ERK1和2介导TCR诱导的SMAD连接区磷酸化并抑制TGF-β诱导的Treg分化
（A、B）WT或dKO CD4+在指定的时间段内，用抗CD3+抗CD28抗体（抗CD3+28）（A）或PMA+离子霉素（PMA+Ion）（B）刺激T细胞。通过免疫印迹法测定ERK1、2和p38的磷酸化。总ERK2蛋白水平显示为负荷控制。（C，D）重量CD4+如图所示，在存在载体DMSO（Ctl）、MEK1/2抑制剂U0126（ERK-i）或p38抑制剂SB203580（p38-i）或两者{（E+P）-i}的情况下，用抗CD3抗体（C）或PMA治疗（D）激活T细胞。通过免疫印迹法测定SMAD2或SMAD3在其连接区的磷酸化以及ERK1和2、p38在其激活环的磷酸化。测定ERK2蛋白水平作为负荷控制。NT，非刺激细胞。（E） 如图所示，在不存在抑制剂（Ctl）、MEK1抑制剂（ERK-i）或p38抑制剂（p38-i）或两种抑制剂（ERK-i+p38-i）的情况下，将WT原始CD4 T细胞分化为不含TGF-β或1 ng/ml TGF-？的Treg细胞。Foxp3系列+如图2所示，五天后通过流式细胞术测定Treg细胞。（A-E）所提供的数据代表了三个独立的实验。
图6
图6。MEKK2和MEKK3通过调节R-SMAD连接子磷酸化调节Treg和Th17分化
WT（A）或dKO CD4+如图2所示，T细胞（B）分别在Treg或Th17条件下分化，但在细胞感染空逆转录病毒（GFP）或表达WT-SMAD3或EPSM-SMAD4的逆转录病毒时，在24小时时添加TGF-β（1 ng/ml）。36小时重复感染一次。5天后，通过GFP表达测定感染细胞，并分析Foxp3+细胞直接（上面板），或分析IL-17A+用PMA+离子霉素重新刺激4小时后的细胞（下面板）。图中的数字显示了门控种群的百分比。数据是两个独立实验的代表。
图7
图7。地图3k2-/-地图3k3Lck-Cre公司/-小鼠在急性炎症反应中表现出更严重的EAE疾病并积聚更多的Th17细胞
（A） 用MOG免疫WT（n=5）和dKO（n=4）小鼠35-55+CFA加百日咳毒素诱发EAE病。观察免疫小鼠的指定时间长度，并测定EAE严重程度的平均临床评分。（B） 亚致死辐照抹布1-/-用dKO（n=4）或WT（n=5）骨髓细胞重建小鼠。重建10周后，按照A组所述对EAE疾病进行诱导和分析。（A-B）所示数据是两个独立实验的代表性数据。误差条显示平均值的标准误差。**，双尾Student的p<0.01，*，p<0.05t吨测试。（C、D）。如A组所述，在WT或dKO小鼠中诱发EAE疾病。免疫后28天，CD4+从中枢神经系统（CNS）或脾脏（SPL）中的总白细胞门控T细胞，并进一步分析IL-17A的频率+和IFN-γ+单元格（C）和Foxp3+流式细胞术检测细胞（D）。图中的数字表示门控种群的百分比。所示数据代表三个独立实验。（E，F）在MOG+CFA免疫后第8天，用指定浓度的MOG肽重新刺激WT或dKO脾细胞在体外三天后通过ELISA测定培养上清中IL-17A（E）和IFN-γ（F）的产生。所示数据为三倍的平均值。误差条显示标准偏差。该结果代表了来自两个独立实验的每种基因型的四只小鼠。**，双尾学生的p<0.01t吨测试。
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