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.2010年10月7日；5（10）：e13191。
doi:10.1371/journal.pone.0013191。

信号转导蛋白阵列分析将LRRK2与调节神经元可塑性的Ste20激酶和PKC zeta联系起来

苏珊·扎克 1, 桑德拉·费尔克, 弗兰克·吉拉德
附属公司

信号转导蛋白阵列分析将LRRK2与调节神经元可塑性的Ste20激酶和PKC zeta联系起来

苏珊娜·扎克等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的显性突变是帕金森病最常见的遗传原因，但其潜在的致病机制尚不清楚。一些体外研究表明，最常见的突变LRRK2（G2019S）增加了激酶活性并损害了神经元存活。LRRK2与有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶家族和基于激酶域内序列相似性和体外底物磷酸化的受体相互作用蛋白激酶有关。

方法/主要发现：我们使用一种无偏见的蛋白质组学方法来确定LRRK2可能激活的激酶信号通路。通过培养含有260个信号转导蛋白的蛋白质微阵列，我们分别检测到四个排列的Ste20丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员（TAOK3、STK3、ST K24、STK25）作为新的LRRK2底物和LRRK_2相互作用蛋白。此外，我们发现蛋白激酶C（PKC）zeta在体内外结合并磷酸化LRRK2。

结论/意义：在生理条件下，Ste20激酶和PKC zeta有助于神经元Tau磷酸化、突起生长和突触可塑性。我们的数据表明，这些激酶也可能参与转基因小鼠和携带有毒功能增强LRRK2突变的人类PD患者的突触功能障碍和轴突断裂。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者是Boehringer Ingelheim Pharma GmbH&Co KG的员工。资金不会改变对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

图1
图1。重组LRRK2结合并磷酸化排列的丝氨酸/苏氨酸激酶25。
（A） 用GST-标记的LRRK2（G2019S）（氨基酸970-2527）和[γ-33P] ATP（左侧面板）或缓冲器和[γ-33P] ATP（右侧面板）。磷屏图像显示，在丝氨酸/苏氨酸激酶25的四倍斑点中，LRRK2处理的蛋白质阵列上的放射性信号强度增加。（B） 用GST标记的LRRK2（G2019S）和冷ATP（左图）或重组GST和冷ATP（右图）孵育的阵列。通过Alexa 488缀合的抗GST抗体检测与斑点丝氨酸/苏氨酸激酶25结合的GST标记的LRRK2。经GST处理的控制阵列为阴性。左上角可见Cy3标记的重复蛋白斑点的橙色荧光，作为图像分析期间网格对齐的标记。
图2
图2。LRRK2磷酸化蛋白质微阵列上的受体相互作用激酶2。
与LRRK2（G2019S）和[γ-33P] ATP（左侧面板）或缓冲器和[γ-33P] ATP（右侧面板）。当与重组LRRK2（G2019S）孵育时，受体相互作用激酶2的四重位点显示出增强的放射性信号。
图3
图3。LRRK2与斑点蛋白激酶C zeta结合并磷酸化。
用（A）GST-标记的LRRK2（G2019S）和[γ-33P] ATP（左侧面板）或缓冲器和[γ-33P] ATP（右侧面板），（B）GST-标记的LRRK2（G2019S）和冷ATP或重组GST和冷ATP，（C）激酶活性GST-标签的LRRK1（D1994A）和[γ-33P] ATP或缓冲器和[γ-33P] ATP。（A和C）在蛋白激酶C zeta的四重斑点中，LRRK2处理的蛋白质阵列上，放射性信号强度明显增加。（B） GST标记的LRRK2与斑点蛋白激酶C zeta结合，通过Alexa 488-偶联的抗GST抗体可见。控制阵列仅显示背景信号。左上角可见Cy3标记的重复蛋白斑点的橙色荧光，作为图像分析期间网格对齐的标记。
图4
图4。重组蛋白激酶C zeta在溶液中磷酸化LRRK2片段。
（上面板）通过重组蛋白激酶C zeta证明GST-标记的LRRK2（G2019S）（氨基酸970-2527）（第1道）、GST-标签的野生型LRRK1（第2道）和激酶不活跃的GST-标志的LRRK1（D1994A）（第3道）磷酸化的自射线照片体外在缺乏蛋白激酶C zeta的情况下，这三种激酶的背景自动磷酸化如第5-7栏所示。GST标记的moesin不是蛋白激酶C zeta的底物，不包括通过蛋白激酶C zeta进行的GST磷酸化（第4道）。（下面板）凝胶考马斯蓝蛋白染色显示重组LRRK2的数量相似。
图5
图5。蛋白激酶C zeta磷酸化全长LRRK2体外.
（上面板）显示全长野生型LRRK2（第2、4通道）和全长激酶头LRRK1（K1906M）（第1、3通道）通过重组蛋白激酶C zeta（第1和2通道）磷酸化的放射自显影图体外（下图）考马斯蓝蛋白染色显示相似量的重组LRRK2。可见两个LRRK2片段在250kDa以下迁移，它们也被蛋白激酶Cζ磷酸化。
图6
图6。LRRK2与小鼠脑中的蛋白激酶C zeta共同免疫沉淀。
C57BL/6小鼠脑匀浆与抗蛋白激酶C zeta抗体（第2道）或免疫前血清（第1道）孵育。使用蛋白G-sepharose珠沉淀免疫复合物，并使用抗LRRK2抗体（上面板）或抗蛋白激酶C zeta抗体（下面板）进行凝胶电泳和免疫印迹。显示了重复两次的实验的代表性结果。
图7
图7。LRRK2磷酸化MARKK体外.
（左面板）显示GST-标记的LRRK2（G2019S）（氨基酸970-2527）（第2通道）对重组激酶活性MARKK（K57A）磷酸化的自射线照片。Kinase-in-active GST-tagged LRRK2（D1994A）用作阴性对照（1号车道）。与LRRK2共同纯化的内源性微管蛋白β也被磷酸化。（右面板）考马斯蓝蛋白染色显示重组蛋白的数量相似。
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