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.2010年8月20日；142(4):590-600.
doi:10.1016/j.cell.2010.07.018。

ATG12与ATG3结合调节线粒体稳态和细胞死亡

Lilliana Radoshevich公司 1, 林赛·默罗, 陈楠（Nan Chen）, 埃斯特凡妮亚·费尔南德斯, 斯里鲁帕·罗伊, 克里斯托弗·冯, 贾扬塔·德伯纳
附属公司

ATG12与ATG3结合调节线粒体稳态和细胞死亡

Lilliana Radoshevich公司等。 单元格. .

摘要

ATG12是一种大分子自噬所需的泛素样修饰物，它有一个已知的单一结合靶点，另一个自噬调节因子称为ATG5。在这里，我们确定ATG3是ATG12共轭的底物。ATG3是自噬过程中ATG8/LC3脂质氧化所必需的类E2酶。ATG12-ATG3复合物的形成需要ATG7作为E1酶，ATG3的自催化活性作为E2，导致ATG12与ATG3上的单个赖氨酸共价连接。令人惊讶的是，破坏ATG12与ATG3的结合不会影响饥饿诱导的自噬。相反，缺乏ATG12-ATG3复合物的形成会导致线粒体质量的增加，并抑制线粒体途径介导的细胞死亡。总的来说，这些结果揭示了ATG12-ATG3在线粒体内稳态中的作用，并暗示了ATG12结合系统在细胞功能中的作用不同于自噬体形成的早期步骤。

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数字

图1
图1。ATG12共价修饰哺乳动物细胞中的多个蛋白靶点
（A） ATG12结构示意图：FHA-ATG12是在N末端用FLAG和HA表位串联标记的小鼠ATG12。在FHA-Stop中，结合所需的ATG12中的C端甘氨酸被Stop密码子取代。（B） 裂解稳定表达空载体（MSCV）、FHA-ATG12和FHA-Stop的MCF10A细胞，并用α-ATG12抗体和α-HA抗体进行免疫印迹。星号（*）表示α-HA免疫印迹中的非特异性带。（C） 用α-FLAG对稳定表达所示结构的MCF10A细胞进行裂解和免疫沉淀；免疫复合物用SDS-PAGE溶解并用α-ATG12免疫印迹。（D） 对稳定表达所示结构的HeLa细胞进行裂解，并用α-HA进行免疫印迹。（E）第7天+/+（重量）和第7天对稳定表达所示结构的−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行裂解，并用α-HA进行免疫印迹。星号（*）表示非特定带。（F） 左侧：第5天+/+（重量）和第5天用α-HA或α-ATG5对稳定表达−/−的所示结构进行裂解和免疫印迹。右侧：WT和第5天用α-FLAG对表达FHA-ATG12的−/−MEF进行裂解和免疫沉淀；用α-HA溶解免疫复合物并进行免疫印迹。
图2
图2。ATG12和ATG3形成共价复合物
（A） 裂解液来自第5天稳定表达FHA-ATG12或FHA-Stop的−/−MEF用α-FLAG亲和纯化，然后用α-HA抗体亲和纯化。洗脱后的蛋白用SDS-PAGE溶解，用α-HA免疫印迹（左）或考马斯染色（中）。所示双倍体（箭头）中的每个蛋白质分别进行MS/MS分析，均鉴定为ATG3。右：小鼠ATG3的氨基酸序列；下划线序列对应于质谱鉴定的独立肽。（B） 用α-FLAG免疫沉淀MEF中表达所示结构的裂解物；免疫复合物（FLAG IP）用SDS-PAGE溶解，并用α-ATG12或α-ATG3进行免疫印迹。（C） 稳定表达FHA-ATG12的MCF10A细胞感染慢病毒，慢病毒编码非靶向控制shRNA或靶向ATG3的shRNA（shATG3）。如图所示，对裂解液进行免疫印迹。（D） 野生型和自动变速器组3对稳定表达所示结构的−/−MEF进行裂解，并进行α-HA免疫印迹。（E） 野生型和自动变速器组3裂解稳定表达FHA-ATG12的−/−MEF并进行α-FLAG免疫沉淀；用α-HA溶解免疫复合物并进行免疫印迹。（F） 野生型和自动变速器组3用α-ATG3免疫沉淀−/−MEF；使用SDS-PAGE分解免疫复合物，并进行α-ATG3或α-ATG12免疫印迹。星号（*）表示免疫球蛋白重链。另请参见图S1。
图3
图3。ATG12与ATG3的单个赖氨酸的自动结合
（A） 表达YFP-ATG12、Myc-tagged ATG7和V5-tagged WTATG3或所示ATG3突变体的HEK293T细胞。（B）自动变速器组3然后用空载体（BABE）、野生型ATG3或指示的ATG3突变体稳定重组的−/−MEF用空载体或FHA-ATG12转导。用α-HA免疫印迹法检测ATG12结合蛋白。（C） 酵母ATG3的晶体结构，带有标记的α-螺旋（蓝色）和β-片（紫色）。显示了保守的催化半胱氨酸（小鼠ATG3中的C264，绿色）和与ATG12结合的主要赖氨酸（K243，黄色）的位置。使用PyMOL绘制的图表。（D） 如图所示，293T细胞转染了YFP-ATG12、myc标记的ATG7和HA或V5-tagged的ATG3突变体。（E） 转染Myc标记ATG7、V5标记ATG10、YFP-ATG12和HA标记ATG5或ATG3 C264A的HEK293T细胞；用催化活性的ATG3（C264A）来区分ATG12-ATG3形成过程中ATG10和ATG3的E2活性。另请参见图S2。
图4
图4。在破坏ATG12与ATG3的结合后，饥饿诱导的自噬保持完整
稳定的池自动变速器组3如图所示，实验中使用了表达空载体（BABE）、野生型小鼠ATG3（WTATG3）或无法与ATG12（KR）结合的突变型ATG3的成纤维细胞。（A和B）细胞在完全培养基中生长，在Hank’s缓冲盐溶液（HBSS）中饥饿4h，或用10nM雷帕霉素（B）处理6h。用所示抗体对细胞进行裂解和免疫印迹。使用磷酸化核糖体S6（P-S6）验证雷帕霉素介导的mTORC1抑制。如有指示，在裂解前1小时向细胞中添加巴非霉素A（BafA，10nM）。（C） 表达GFP-LC3的指示细胞类型在完全培养基（对照）或HBSS中培养4h；下面放大了中央面板的方框区域。棒材，25µm。（D） 点状GFP-LC3或GFP-LC2ΔG的量化（每个细胞的平均+/-SEM点状）。（E） 指示的细胞类型在完全培养基（对照）或HBSS中培养4h，然后固定并用α-p62抗体进行免疫染色。棒材，25µm。（F） 用GST-BHMT融合构建物转染显示的细胞类型，HBSS保存6h，用α-GST进行裂解和免疫印迹。星号（*）表示全长GST-BHMT，箭头表示自溶体中产生的裂解BHMT。如有指示，使用巴非霉素A（BafA，10nM）抑制溶酶体功能。α-Myc用于检测GFP-Myc（通过IRES序列表达），以控制转染效率（Dennis和Mercer，2009）。另请参见图S3。
图5
图5。破坏ATG12与ATG3结合对线粒体质量和形态的影响
（A） 左图：相对于自动变速器组3−/−细胞表达空载体（BABE）。使用ANOVA计算统计显著性，然后使用Tukey的HSD测试。右：MTG荧光强度（3个实验的平均+/-SEM）自动变速器组3+/+单元格相对于自动变速器组3−/−细胞。（B） 用α-COX IV、α-微管蛋白和α-V5对所示细胞类型的裂解液进行免疫印迹。（C） 用TOM20（顶部和中部）或细胞色素C（底部）抗体对指示的细胞类型进行免疫染色。（D） 从TOM20免疫染色图像中量化纯碎片/圆形形态或纯管状形态的细胞百分比。结果是来自5个实验的平均+/-SEM，其中每个单独的实验在每个条件下至少对250个细胞进行了评分。使用ANOVA计算统计显著性，然后使用Tukey的HSD测试。（E） 用聚乙二醇对表达线粒体靶向dsRed（mt-dsRed，红色）或CFP（mt-CFP，绿色）的细胞进行杂交，以评估线粒体融合活性。显示了来自每种细胞类型的细胞杂交体的代表性合并图像；这些信号（黄色）在细胞杂种中的共定位表明线粒体融合（Chen等人，2003年）。每个底部面板都是上面相应面板中盒装插图的放大版。棒材，25µm。另请参见图S4和S5。
图6
图6。CCCP处理对表达非结合ATG3突变体（KR）细胞线粒体的影响
（A） 左：用10µM CCCP处理细胞24小时并用MTG染色。MTG荧光强度（8次实验的平均+/-SEM）相对于自动变速器组3显示了表达空载体（BABE）的−/−细胞。使用ANOVA计算统计显著性，然后使用Tukey的HSD测试。右：经CCCP处理的MTG荧光强度（3次实验的平均+/-SEM）自动变速器组3+/+单元格相对于自动变速器组3−/−电池。（B） 按照指示对细胞进行CCCP处理，用针对常驻线粒体蛋白、TOM40和COX IV、V5和微管蛋白的抗体进行裂解和免疫印迹（负载控制）。（C） 用mito-dsRed转染表达GFP-LC3的指示细胞类型，并用10µM CCCP处理24小时。白色箭头表示GFP-LC3和mito-dsRed的共定位。Bar，5µm（D）定量每个细胞的mito-dsRed和GFP-LC3共定位（平均+/-SEM）。（E） CCCP处理期间3MA敏感性线粒体降解（5个实验的平均+/-SEM）。另请参见图S6。
图7
图7。缺乏ATG12-ATG3的细胞表现出线粒体途径介导的细胞死亡减少
用以下试剂处理细胞24小时：（A）100µM CCCP；（B） 100nM葡萄孢菌素；和（C）20ng/mL TNF-α+2.5µg/mL环己酰亚胺。使用流式细胞术通过碘化丙啶摄取测定细胞死亡百分比（平均+/-SEM）。（D） 对从WTATG3和KR细胞制备的裂解液进行免疫印迹，以获得指示标记。（E） 用500 nM奥巴托拉索处理细胞24小时。使用台盼蓝排除法定量细胞死亡（平均+/-SEM）。使用t检验计算统计显著性。（F） 结果的总结模型。
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