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。2010年8月13日；329(5993):805-10.
doi:10.1126/science.1191542。 Epub 2010年7月1日。

外周蛋白质量控制从质膜上去除未折叠的CFTR

Tsukasa Okiyoneda公司 1, 埃尔维·巴里埃, 米克洛斯·巴加尼, 瓦尔·拉贝赫, 开都, 约尔格·霍菲尔德, 杰森·C·杨, Gergely L Lukacs公司
附属公司

外周蛋白质量控制从质膜上去除未折叠的CFTR

Tsukasa Okiyoneda公司等。 科学。 。

摘要

缺乏F508残基的囊性纤维化跨膜电导调节因子（DeltaF508CFTR）恢复生物合成过程的治疗努力受到了来自质膜的非天然解救DeltaF50 8CFTR-的泛素依赖性溶酶体降解的阻碍。这里，功能性小干扰RNA筛选揭示了伴侣蛋白、耳蜗蛋白和泛素结合和连接酶对从细胞表面消除未折叠CFTR的贡献，作为外周蛋白质量控制系统的一部分。非天然CFTR的泛素化是有效内化和溶酶体降解所必需的。这种外周蛋白质量控制机制可能通过降解从内质网质量控制中逃逸或原位环境胁迫产生的受损质膜蛋白，参与维持细胞内环境稳定。

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数字

图1
图1
构象失稳的rΔF508CFTR是泛素化的，并以ESCRT依赖性降解为目标。(A类)采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定CFTR颗粒的稳定性。ΔF508CFTR在26°C下保存36小时，然后在37°C下孵育2.5小时（rΔF）或26°C。(B类)用ELISA法测定（左）CFTR内化和（右）内吞再循环。rΔF508CFTR的展开在37°C下完成（2.5小时）。(C类)通过免疫印迹和密度测定法对剩余全长CFTR进行定量，测量微粒体中CFTR变体的胰蛋白酶敏感性。B带和C带分别表示核心和复合糖基化CFTR。(D类)rΔF508CFTR在高尔基后亚区的泛素化用d-IP测量，并对沉淀中的CFTR进行归一化。未挽救的ΔF508CFTR（ΔF）用作阳性对照。(E类和F类)通过37°C下的CHX追踪和ESCRT KD HeLa细胞（E）中抗HA抗体的免疫印迹测定rΔF508CFTR的代谢稳定性。剩余的复合糖基化CFTR通过密度测定法定量，并表示为初始量的百分比（F）。使用SMARTpool（p）或单个siRNA（1和2）。siNT；非靶向siRNA。
图2
图2
CHIP介导PM中rΔF508CFTR的消除(A类)功能性siRNA筛选，以确定负责从HeLa细胞PM中清除rΔF508CFTR的Ub连接酶。Ub连接酶被50 nM SMARTpool siRNA击倒，rΔF508CFTR PM稳定性在37°C下通过ELISA测定。TSG101 siRNA；阳性对照。数据是来自两个或三个独立的四硅酸盐实验的平均值±SEM。(B类)Ub连接酶或UbcH5c KD对IB3细胞中rΔF508CFTR PM稳定性的影响。(C类)利用SMARTpool siRNA对CHIP KD进行CHX追踪免疫印迹，测定高尔基后亚群的rΔF508CFTR代谢稳定性。绘制剩余的复合糖基化CFTR。(D类)在37°C下测量CHIP-KD细胞中CFTRs（5分钟）、TfR（5 min）和CD4Tcc-Ub（AllRΔG）（2.5分钟）的内化。(E类)CHIP KD增强了rΔF508CFTR内吞再循环。(F类)如（A）所示，测量E2-KD细胞中rΔF508CFTR PM的稳定性。
图3
图3
rΔF508CFTR泛素化受伴侣和共同伴侣调节。(A类)如图1D所示，在SMARTpool siRNA转染的HeLa细胞中测量高尔基体后隔室中的rΔF508CFTR泛素化。(B类)免疫印迹（A）和（G）中CFTR泛素化的定量。将沉淀中CFTR的信号归一化，并表示为去折叠（37°C，2.5小时）后siNT处理细胞中rΔF508CFTR泛素化的百分比，如图1D所示。(C类)在共表达myc-CHIP变异体的COS7细胞中，用ELISA法测定（左）PM稳定性和（右）rΔF508CFTR内化。(D类)在转染myc-CHIP变体的HeLa细胞中，CHIP与核心和复合糖基化rΔF508CFTR相互作用。(E类)经0.1 mM二硫代双[丙酸丁二酰亚胺]（DSP）体内交联后，HeLa细胞中的co-IP显示伴侣与复合糖基化rΔF508CFTR的相互作用。通过CHX追逐使核心糖基化wt和rΔF508CFTR最小化（车道3和4）。(F类)rΔF508CFTR PM稳定性通过SMARTpool siRNA根据伴侣或耳蜗酮的KD进行评估，如图2A所示。数据是来自两个或三个独立的四硅酸盐实验的平均值±SEM。(G公司)如（A）所示，在SMARTpool siRNA-转染的HeLa细胞中，对高尔基后亚群的rΔF508CFTR泛素化进行了测量。
图4
图4
rΔF508CFTR的内化和溶酶体靶向性受不同的伴侣和耳蜗调节。(A类)如图2D所示，测定未折叠rΔF508CFTR（5分钟）、TfR（5分钟。(B类和C类)通过测量早期内体到溶酶体的酸化率，检测伴侣酮或耳蜗酮KD对（B）rΔF508CFTR和（C）Lamp2/CD63溶酶体分选的影响（见图S9）。(D类)通过CHX追踪免疫印迹法测定SMARTpool siRNA-转染HeLa细胞中（左）核心糖基化ΔF508CFTR和（右）复合糖基化rΔF50 8CFR的代谢稳定性。(E类)在（D）所示的实验中，CFTR消失通过密度测定法定量，并表示为初始量（T-0）的百分比。每个样本的条形图表示0-3小时和0-6小时追踪的数据（顶部）。MG132和巴非霉素A1（BafA1）分别是ERAD和溶酶体降解的阳性对照。
图5
图5
外围质量控制机制使展开的CFTR无所不在，并规定PM水平。(A类)体外重组rΔF508CFTR泛素化。纯化复合糖基化rΔF508CFTR-His10与E1、UbcH5c、CHIP、Hsc70、Ub-Myc和ATP在30°C下孵育2小时。用d-IP分离rΔF508CFTR并进行免疫印迹分析。(B类)重组Hsc70刺激来自富含PM的囊泡的纯化rΔF508CFTR的CHIP依赖性泛素化。(C类)Wt和rΔF508 CFR-His10如在（B）中一样被纯化和泛素化。(D类)根据伴侣/耳蜗酮对rΔF508CFTR PM密度（图S5E）和稳定性的影响进行分类（图2A和3F）。已识别的外围QC机器的部件以较大的类型表示。(E类)rΔF508CFTR外周蛋白QC的工作模型。
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