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.2010年6月15日；17(6):547-59.
doi:10.1016/j.ccr.2010.04.026。

综合基因组和蛋白质组分析确定Lkb1缺陷型转移性肺肿瘤的靶点

朱利安·卡雷特罗 1, 岛村武史, 克拉丽萨·里科娃, 秋季L Jackson, 马修·德威尔克森, 克里斯塔·博格曼, 马修·斯巴特拉齐, 本杰明·萨诺夫斯基, 凯特·L·麦克纳马拉, 凯萨琳·A·布兰德斯特, 赞德拉·E·沃尔顿, 丁磊谷, 杰弗里·西尔瓦, 凯瑟琳·克罗斯比, 杰弗里·夏皮罗, Sauveur-Michel Maira公司, 季洪斌, 迭戈·H·卡斯特里隆, 卡拉·F·金, 卡洛斯·加西亚·埃切弗里亚, 纳比尔·巴迪西, 诺曼·夏普莱斯, 尼尔·D·海斯, 威廉·Y·金, 杰弗里·恩格曼, 王国健
附属公司

综合基因组和蛋白质组分析确定Lkb1缺陷型转移性肺肿瘤的靶点

朱利安·卡雷特罗等。 癌细胞. .

摘要

在小鼠中，Kras（G12D）的Lkb1缺失和激活导致肺肿瘤具有高外显率的淋巴结和远处转移。我们利用整合的基因组和蛋白质组分析了这些原发性和转移性新发肺癌，并确定了与Lkb1丢失和进展为侵袭性和转移型肺癌相关的基因和磷酸蛋白特征。这些研究表明，在Lkb1缺乏的原发性和转移性肺肿瘤中，SRC被激活，SRC、PI3K和MEK1/2的联合抑制导致协同肿瘤消退。这些研究表明，综合基因组和蛋白质组分析可用于确定可能靶向治疗的信号通路。

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数字

图1
图1。转移的基因表达特征来自于喀斯特-驱动，磅1-缺陷小鼠肺癌模型预测人类非小细胞肺癌的生存率
答：。生成转移的表达特征。克拉/Lkb1原发肿瘤与克拉/Lkb1转移瘤采用两类非配对差异表达分析，假发现率（FDR）<0.01。共有757个独特的转录本被显著差异性地解除管制，并用于定义转移基因特征（Mets）。B。Kaplan-Meier对Director's Challenge Consortium数据集（N=180）和Memorial Sloan Kettering Cancer Center数据集2（N=98）的人类肺部肿瘤进行分析，比较显示我们的小鼠Mets签名激活（红线）或失活（绿线）的肿瘤之间的总体生存率。红线=已激活Mets签名。绿线=已禁用Mets签名。C、。通过基因集富集分析得出的相对富集分数的热图。肿瘤以列表示，基因特征以行表示（红色表示过度表达基因的显著富集；绿色表示未表达基因的明显富集；黑色表示不显著；p<0.05）。右侧面板显示了三类肿瘤中每一类肿瘤的总富集分数(克拉斯、克拉斯/Lkb1原发性肿瘤和克拉/Lkb1转移）。另请参见表S1和图S1。
图2
图2。人细胞系和小鼠肿瘤的磷蛋白谱分析
答：。确定的磷酸酪氨酸位点的维恩图克拉/Lkb1原发性与转移性小鼠肿瘤以及表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非靶向shRNA（NT）的等基因配对细胞系（NCI-H358和BEAS-2B）。Western blot显示LKB1敲除（LKB1D）在NCI-H358和BEAS-2B细胞中的有效性。括号中的红色数字显示在每次比较中磷酸酪氨酸位点的不同增加或减少。B。协调调节的LKB1依赖性磷酸酪氨酸位点表。列出了LKB1依赖的磷酸化酪氨酸位点的详细信息，这些位点在数据集中被协调调节，包括磷酸化蛋白、酪氨酸位点、对数热图2指示比较的比率（红色，正对数2比率；蓝色，负对数2比率），以及假定的上游激酶。GEP（基因表达谱）数据列显示了编码这些蛋白质的基因在克拉/Lkb1（初级或中级）与喀斯特小鼠肿瘤比较（红点=显著过表达，绿点=显著低表达，橙色点=无显著变化）。1从PhosphoELM、HPRD和Swissprot数据库获得的上游激酶；2从NetworKIN数据库获得的上游激酶。另请参见图S2。
图3
图3。病灶粘连受损克拉/Lkb1肿瘤和转移
我们的基因组和蛋白质组分析的大多数相关结果都描述在焦点粘附KEGG通路上。在磷聚糖分析比较中，红色标记的蛋白质被过度磷酸化克拉/Lkb1原发性肿瘤和转移性肿瘤内磷蛋白分析的比较克拉/Lkb1原发性肿瘤和转移瘤喀斯特单独肿瘤。（图2B）。在基因表达谱比较中，发现标记在橙色中的蛋白质过度表达（或其特征被丰富）克拉/Lkb1原发性肿瘤和转移瘤喀斯特单独肿瘤（图1A和1C）。
图4
图4。LKB1敲除激活EMT标记物，即局部粘附动力学的介质，并增强细胞运动
答：。NCI-H358细胞的蛋白质印迹分析(LKB1号机组野生型，KRAS公司G12C突变体）感染慢病毒，慢病毒编码4个不同序列的靶向LKB1或非靶向shRNA（NT）的shRNA（A-D）。用LKB1特异性抗体或针对SRC（Total和Y416）、FAK（Totals和Y576）、paxillin（Total和Y118）、E-Caddherin和vimentin的酪氨酸特异性抗体模拟全细胞裂解物。α/β-肌动蛋白（actin）作为负载对照。B。在用移液管尖端受伤12小时后，NCIH358细胞汇合单层的划痕区域的代表性照片，这些细胞表达一种shRNA到LKB1（LKB1D）或一种非靶向shRNA（NT）。C、。将表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非靶向shRNA（NT）的NCI-H358细胞置于涂有基质凝胶的Boyden培养箱中，以10%FBS作为化学引诱剂，进行48小时的侵袭试验。数据以3个重复±SD的平均值绘制。D。NCI-H358异种移植物的平均肿瘤体积测量。在裸鼠皮下培养人肺癌细胞NCI-H358，表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非靶向shRNA（NT）。14天后测量肿瘤并计算肿瘤体积（误差棒=1 SD；n=5，p=0.043）。E.公司。NCIH358 NT和LKB1D异种移植物中人波形蛋白和人细胞角蛋白的免疫组织化学染色。另请参见图S3。
图5
图5。LKB1敲除与FAK和SRC抑制协同作用，防止NCI-H358细胞中胶原粘附和迁移
答：。将表达shRNA至LKB1或非特异性shRNA（NT）的指数生长NCI-H358细胞接种于5×105在含有二甲基亚砜（对照）、10nM达萨替尼（SRC抑制剂）或100nM PF 573228（FAK抑制剂）的情况下，细胞被I型胶原、IV型胶原或BSA包裹，并粘附在基质上。90分钟后，洗去松散的细胞，固定并染色粘附细胞。B。将表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非特异性shRNA（NT）的NCI-H358细胞接种于1×105细胞/孔置于胶原I涂层的96孔板上，该板含有二甲基亚砜或增加浓度的达萨替尼或PF573228，并孵育90分钟。数据点表示与DMSO处理的细胞相比，标准化值的平均值，表示为粘附率的%，该值来自两个独立的实验，共进行了三次；误差条=SD。C类将表达shRNA至LKB1（LKB1D）或非特异性shRNA（NT）的NCI-H358细胞接种于1×105细胞/孔延伸至24孔，细胞生长直至形成融合单层。用移液管尖端划伤单层，形成伤口，细胞在含有二甲基亚砜或达萨替尼或PF573228浓度增加的培养基中生长。在汇合单层损伤12小时后，测量伤口闭合度，并表示为原始伤口闭合度的%。数据以3个重复±SD的平均值绘制。
图6
图6。PI3K、MEK和SRC抑制剂联合治疗可产生协同效应体内的响应磅1缺陷性小鼠肺肿瘤
答：。每组治疗前后的典型MRI图像。每组小鼠均进行MRI成像，然后每天按以下剂量处理两周：45 mg/kg BEZ235、25mg/kg AZD6244和15 mg/kg Dasatinib，然后再次成像。肿瘤体积归一化为预处理肿瘤体积。显示了每个治疗组3-7只小鼠的平均肿瘤体积。误差条=1 SD（与预处理相比，0.05 BEZ/AZD/达沙替尼治疗）。B类H&E染色。代表的H&E部分克拉/Lkb1使用指定药物治疗的动物肿瘤。另请参见表S2和S3。
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