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.2010年4月23日；38(2):265-79.
doi:10.1016/j.molcel.2010.04.007。

聚集蛋白的选择性大自噬降解需要PI3P结合蛋白Alfy

玛丽亚·菲利莫连科 1, 波琳·伊萨克森, 金·D·芬利, 莫妮克·安德森, Hyun Jeong先生, 托马斯·梅利亚, 布莱恩·巴特利特, 凯瑟琳·迈尔斯, 汉纳·C·G·伯克兰, 特隆·拉马克, 迪米特里·克莱因, 安德烈亚斯·布雷奇, 哈拉尔德·斯坦马克, 安妮·西蒙森, 山本爱
附属公司

聚集蛋白的选择性宏观自噬降解需要PI3P结合蛋白Alfy

玛丽亚·菲利莫连科等。 分子电池. .

摘要

越来越多的证据表明，大分子自噬货物不仅限于对饥饿作出反应的大量胞浆，而且可以选择性地用于底物，包括聚集蛋白。然而，目前尚不清楚饥饿诱导的和选择性的大自噬是否共享相同的适配器分子来捕获货物。在这里，我们报道了Alfy，一种磷脂酰肌醇3-磷酸结合蛋白，是选择性消除聚集蛋白的核心。我们报告说，Alfy的丢失抑制了内含物的清除，对饥饿反应几乎没有影响。Alfy被招募到细胞内包涵体中，并在p62（SQSTM1）阳性蛋白和自噬效应物Atg5、Atg12、Atg16L和LC3之间构建复合物。Alfy过度表达导致以依赖Atg5的方式消除聚集物，同样，在聚谷氨酰胺毒性的神经元和果蝇模型中也起到保护作用。我们认为Alfy通过桥接货物和构建自噬体的分子机制，在选择性大自噬中发挥关键作用。

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数字

图1
图1
聚谷氨酰胺聚集体存在于自噬液泡中。A–G。免疫电镜可以在双层膜结构中发现聚谷氨酰胺聚集体，并在细胞分馏实验的自噬体部分中发现。A–C。Htt103Q-mCFP细胞系的免疫电镜分析。用BafA1处理细胞4h，然后固定。金颗粒标记mCFP阳性结构。答：。无膜骨料。B。双层膜中隔离的骨料。C、。细胞质（Cyto）与固着（Seq）聚集体的定量。GFP阳性聚集物根据直径（<或>1μm）进行分类，然后进行计数1μm聚集体更可能被隔离在自噬体中（细胞：2.11+0.408；序列：4.10+0.689），而>1μm的聚集体是细胞溶质（细胞：3.94+0.372；序列：1.40+0.700）。在n=3个实验中计算了185个细胞。数据显示为平均值+SEM。D–G。使用两种不同方案进行的细胞分离实验表明，在自噬体（AV）组分中可以发现SDS不溶性Htt103QmCFP阳性蛋白。D。使用的分馏方案摘要。E.公司。使用Nycodenz协议从AV片段生成的CryoEM图像。F、。细胞组分的免疫印迹分析。LC3 II富含AV级分。G.公司。AV组分的免疫印迹显示，尽管使用变性条件，凝胶的加载堆栈中仍存在SDS不溶性Htt103Q-mCFP。SDS-PAGE使用4–12%聚丙烯酰胺凝胶。
图2
图2
Alfy从细胞核转位，需要清除聚集的polyQ。A–F。Alfy从细胞核转移到细胞质结构答：。Alfy定位于未经处理的HeLa细胞的核膜，并与核孔蛋白共定位。B。用Flag-HttQ68（红色）转染HeLa细胞，并检测内源性Alfy（绿色）。插图显示了Alfy和polyQ包裹体的共同定位（黄色）。C、 D。40h后用5nM钩体霉素B处理Flag-HttQ68（绿色）转染细胞4h，固定并用抗Alfy抗体（红色）染色。Draq5（蓝色）标记细胞核。比例尺=10μm。LMB治疗抑制了Alfy向细胞质内含物的募集（30个细胞，2个独立实验。学生t检验：p<0.005）。E.公司。LMB在营养丰富和营养缺乏的条件下抑制Alfy转运。HeLa细胞在HBSS±LMB中饥饿45min。对含有细胞质Alfy阳性结构的细胞进行计数（n=3个实验中的n>300个细胞）。F类用dox处理Htt103Q-mCFP细胞以消除表达（7d）。然后删除Dox以重新建立表达式。在第0、2、6和10天收集细胞。通过qRT-PCR测定Alfy mRNA的相对水平，并将其归一化为d0。以TBP和肌动蛋白为对照。N=2个实验重复进行。G–I型，要求Alfy清理膨胀polyQ骨料。G公司Htt103Q-mCFP细胞的mCFP点状细胞数量。100μg/mL dox持续5d后，“含有聚集物的细胞百分比”显著降低（p<0.001）。siALFY1和siALFY2显著抑制清除（*：p<0.001），而siCTRL没有（p=0.3218）。所示INCA3000上生成的每组典型共焦图像。细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色，HttQ103-mCFP点呈绿色。H、 我用siCTRL或siALFY转染Htt65Q-和Htt103Q-mCFP，并在48小时后暴露于dox达3d。H。Alfy KD抑制了65Q（p<0.05）和103Q（p<0.05）细胞对SDS不溶蛋白的清除(学生t检验). 如SDS-PAGE所示，在SDS可溶性蛋白中未发现可检测的变化。5mM 3MA持续48h作为宏观自噬对照。我Alfy-KD和Atg5KD抑制SDS不溶性夹杂物的清除。数据显示为平均值+标准偏差。完整统计数据可在数字统计信息下的补充材料中找到
图3
图3
饥饿诱导的自噬不需要Alfy。A类LLP降解不需要Alfy。氨基酸戒断对HeLa和N2a细胞中的氨基酸戒断（Starv）都有显著影响。敲除Alfy对LLP降解没有显著影响（HeLa:p=0.6991；N2a:p=0.3505）。为了确保LLP降解是由于宏观自噬，还进行了+10mM 3MA的饥饿实验。用siCTRL或siALFY转染细胞，然后在72小时后监测LLP降解情况（n=3个实验，重复或三次）。B、 C、。苜蓿枯竭对饥饿诱导或基础没有影响(C类)LC3-脂化（p=0.7641；n=4）。转染siALFY或siCTRL的HeLa细胞在完全培养基（CM）中培养4h，或在没有或存在BafA1的情况下饥饿培养（Starv）4h(B类)或2小时(C类).D。阿尔菲损耗对LC3点的形成没有影响。转染siCTRL、siATG7或siALFY的细胞被饥饿、固定并染色以获得内源性LC3。在饥饿的细胞中，siCTRL和siALFY细胞中LC3阳性点状细胞数量显著增加，而siATG7细胞在饥饿时，siCTLR和siATG七（p<0.0001）以及siALFY和siATG七（p<0.0001）之间LC3阳性点显著减少。条形图表示平均值+标准偏差（n=8）。E.公司。EM显示，由于Alfy缺失，自噬体（黑箭头）的形成没有可检测的差异。siALFY或siCTRL转染细胞在固定和成像前饥饿4h。F类.自体溶酶体在果蝇属脂肪体细胞不依赖于Bchs。为了应对饥饿（3h蔗糖，n=3），WT幼虫（n=3(十亿立方英尺三/Df（2L）凝块7，n=3）对该响应没有显著影响（p=0.2151）。作为抑制宏观自噬的一种控制，Atg1（CG-Gal4；UAS-dsAtg1i，n=3）的敲低导致自溶体积累的显著抑制（p=0.0005）。比例尺为50μM。所有条形图表示平均值+标准偏差。完整的统计数据可在数字统计信息下的补充材料中找到。
图4
图4
Alfy与Atg5直接交互答：。Alfy示意图，注明了其BEACH域、WD-40重复序列和FYVE域的位置。数字表示氨基酸。内源性Alfy（红色）与内源性Atg5（绿色，图i）在非饥饿的HeLa细胞中共定位。含有与Atg5（ii，iv，vi）共定位的WD-40重复序列（氨基酸3095–3436）的结构。BEACH（iii）和FYVE结构域（v）的表达均未单独导致Atg5共定位。B。Alfy C-末端和Atg5可在细胞裂解液中的相同复合体中发现。HeLa细胞与所示质粒共转染，并使用抗myc抗体进行IP，然后用抗Alfy或抗myc的抗体进行检测。C、。Atg5直接与GST-下拉确定的Alfy WD-40重复序列相互作用。GST、GST-Atg5、GST-LC3或GST-Syntaxin-7固定在预先清洗的小球上，然后与MBP-Alfy孵育2888–3526结合蛋白通过Alfy免疫印迹进行洗脱和分析。D。Y2H揭示了Atg5-Alfy相互作用。酵母报告菌株L40与pLexa-Atg5和指示的pGAD-Alfy质粒共转化。作为阴性对照，用质粒pLexa-Atg5和pGAD-GH转化该菌株。在与Alfy的WD40重复序列融合的酵母共表达Gal4激活域中检测到正相互作用，报告激活序列结合LexA-Atg5融合，如β-半乳糖苷酶活性（上部）和HIS3型活动（较低）。仅表达FYVE结构域的酵母的报告活性与对照相似。β-半乳糖苷酶单位的值表示为平均值+标准偏差（n=4）。E.公司。内源性Alfy可在WT小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中与内源性Atg5–Atg12的复合体中发现，但在Atg5基因敲除的MEFs中未发现。使用Rb抗Alfy抗体血清对MEF产生的全细胞裂解物进行IP，并检测Atg5。WT MEF中的血清对照Atg5也为阴性。F、。Atg12和Atg16L也可以在与Alfy的复合体中找到。Htt103Q-mCFP细胞产生的全细胞裂解物用GFP或蛋白A珠免疫沉淀作为阴性对照。
图5
图5
Alfy是一个具有聚集倾向的突变体亨廷顿蛋白和内源性Atg5、p62、NBR1和LC3的复合物。答：。来自稳定细胞系或HD原代神经元模型的全细胞裂解物的Co-IP实验。来自稳定细胞系Htt25Q-、Htt65Q-和Htt103Q-mCFP的裂解物首先通过外显子1Htt蛋白的CFP-tag进行免疫沉淀，然后用抗Alfy、p62、Atg5、Atg7和LC3的抗体检测内源性蛋白，并重复检测Htt。用携带外显子1Htt72Q-GFP的慢病毒转导的原代神经元首先进行Htt免疫沉淀，然后用Alfy、p62和LC3抗体进行检测，然后进行Htt复制。B。带有外显子1Htt-mCFP的Alfy co-IPs的myc标记的N末端和C末端片段。用抗GFP的抗体对103QmCFP进行IPed，该抗体也能识别mCFP标签。C、。用来自对照组或HD患者成纤维细胞的全细胞裂解物的抗Alfy血清进行Co-IP实验。在HD患者样本中，Alfy与突变体亨廷顿蛋白p62、Atg5和LC3共表达IP，但不表达Atg7。Alfy仍然在未受影响的患者样本中联合使用IPs p62、Atg5和LC3，这表明Alfy可能识别出非HD聚集物。D–E类。Alfy需要将Atg5和LC3带到综合体。实验与B相似，但在用siRNA或shRNA转染Alfy或Ctrl序列后。天.Htt103Q mCFP细胞系。电子。大鼠初级皮层神经元。免疫印迹（用抗GFP、Alfy、p62、Atg5和LC3的抗体）都在同一印迹上进行。根据Htt输入水平，5F的转导效率不如5B。所有IP实验都是来自至少3个独立实验的代表性图像。F类内源性Alfy、p62和NBR1均定位于65Q mCFP聚集体G.公司。NBR1与易于聚集的突变体亨廷顿蛋白形成复合物。对Htt65Q-和Htt103Q-mCFP进行IP'ed，并对NBR1进行杂交
图6
图6
Alfy/Bchs过度表达导致HD原代神经元模型中内含物消失，并且HD的神经毒性降低果蝇属polyQ毒性眼模型。A、 B。HD慢病毒模型中Alfy的过度表达导致大鼠初级皮层神经元中的内含物减少。答：。用MAB5492对抗外显子1Htt（绿色）的IF显示，转导的神经元在整个细胞中表现出强大的聚集，包括胞体和突起（白色箭头）以及细胞核（n）。阿尔菲的转染1–1271（p=0.4241）和阿尔菲2285–2981（p=0.3325）对内含物/神经元的数量没有显著影响。相反，阿尔菲的表情2981–3526导致神经元总负荷显著降低（p<0.001）。视野中可见的绿色点状物与红色不共存，这归因于非Alfy转染神经元的神经元过程。B。每个细胞的内含物数量计入所示的细胞数量。对核中心100米半径范围内所有可见的点状物进行计数。如果点状物（绿色）与表达番茄荧光团（红色）的细胞质共存，则认为细胞位于细胞内。C、 D。Alfy/Bchs在果蝇属眼睛可以防止polyQ毒性。C、。广州-S对照蝇（野生型）显示出正常的成虫色素沉着特征和小体特征果蝇属眼睛。使用pGMR-Gal4驱动程序表达polyQ127肽（UAS-PolyQ-127，n=20）会导致眼部出现明显缺陷，包括坏死区域（pGMR-Gal4/UAS-Poly Q-127箭头，n=20.）。全长Bchs的共同表达（pGMR-Gal4，UAS-PolyQ-127/UAS-EP-Bchs，n=20）降低了可观察到的坏死水平。PolyQ127肽与Bchs的C末端区域（pGMR-Gal4，UAS-PolyQ-127/UAS-Bchs-C1000，n=20）共表达导致抑制这种外部毒性表型。共表达dsAtg8a（pGMR-Gal4，UAS-PolyQ-127/UAS-bchs-C1000/UAS-dsAtg9a，n=15）RNAi转基因阻断了这种保护作用。D。确定坏死区域的数量C类虽然dsAtg8a的共同表达进一步缩小了眼睛大小，但并没有显著改变坏死水平（p=0.2391）。全长和C1000Bchs均显著减少蝇眼坏死（p＜0.0001）。当C1000与抗ATG8a的dsRNA共同表达（p=0.9977）时，这种减少被消除，这显著抑制了发育中眼睛的宏观自噬。完整的统计数据可以在“数字统计信息”下的“补充材料”中找到。
图7
图7
提出了Alfy介导的蛋白质聚集体清除模型。A类扩张型polyQ蛋白的表达导致其多泛素化、积累和聚集。泛素化蛋白可被p62识别。B类在存在聚集蛋白的情况下，Alfy从细胞核转移到胞浆中，在胞浆中通过FYVE结构域、Atg5–Atg12通过WD-40结构域和泛素和p62阳性蛋白与含有PI3P的膜相互作用。p62与LC3直接相互作用，也可能将未结合的LC3带到包合物中。C类.Alfy将不同的成分结合在一起，允许Atg5-Atg12-Atg16L帮助LC3转换为PE结合形式。不确定p62是否结合自由LC3、PE结合LC3或两者；然而，与PE-结合LC3的相互作用可能有助于稳定骨料周围的膜。Atg5–Atg12可能会随着LC3沿着膜发生结合而离开。天聚集物被包装成自噬体，以便在与溶酶体融合时最终降解。不按比例。
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中的注释

  • 通过自噬清除骨料的主导体。
    Deretic V.公司。 Deretic V.公司。 开发单元。2010年5月18日；18(5):694-6. doi:10.1016/j.devcel.2010.04.009。 开发单元。2010 PMID：20493804 免费PMC文章。

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