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。2010年4月20日；107(16):7455-60.
doi:10.1073/pnas.1001006107。 Epub 2010年4月8日。

谷氨酰胺酶2，一种新的p53靶基因，调节能量代谢和抗氧化功能

胡文伟 1, 岑章, 吴锐（Rui Wu）, 伊冯·孙, 阿诺德·勒文, 冯朝晖
附属公司

谷氨酰胺酶2，一种调节能量代谢和抗氧化功能的新型p53靶基因

胡文伟等人。 美国国家科学院程序。 。

摘要

虽然细胞周期阻滞、凋亡和衰老传统上被认为是抑癌基因p53的主要功能，但最近的研究揭示了该蛋白的两个独特功能：p53调节细胞能量代谢和抗氧化防御机制。在这里，我们将谷氨酰胺酶2（GLS2）确定为一个先前未标记的p53靶基因，以介导p53蛋白的这两种功能。GLS2编码一种线粒体谷氨酰胺酶，催化谷氨酰胺水解为谷氨酸。p53在非应激和应激条件下均增加GLS2的表达。GLS2通过增加谷氨酸和α-酮戊二酸的产生来调节细胞能量代谢，这反过来会导致线粒体呼吸和ATP生成的增强。此外，GLS2通过增加还原型谷胱甘肽（GSH）水平和降低ROS水平来调节细胞的抗氧化防御功能，从而保护细胞免受氧化应激（例如H（2）O（2））诱导的凋亡。与GLS2的这些功能一致，p53的激活增加了谷氨酸和α-酮戊二酸水平、线粒体呼吸速率和GSH水平，并降低了细胞中的活性氧（ROS）水平。此外，肝细胞癌中GLS2表达缺失或显著降低，GLS2的过度表达大大减少了肿瘤细胞集落的形成。这些结果表明，作为一个独特的p53靶基因，GLS2是p53在能量代谢和抗氧化防御中的介导者，可以促进其在肿瘤抑制中的作用。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
人类GLS2基因在启动子区含有一个p53 DNA共识结合元件。(A类)p53MH程序预测的人类GLS2基因中的推定p53共识结合元件。N、 任何核苷酸；Pu，嘌呤；Py，金字塔。(B类)ChIP分析检测到p53与人类GLS2启动子区的p53一致性结合元件结合。在分析之前，将V138/H1299细胞移到32°C下24小时。MDM2启动子中的p53结合元件作为阳性对照。DO-1:p53抗体。(C类)p53激活包含GLS2启动子区p53结合元件的报告载体的荧光素酶活性。p53-null H1299和HCT116 p53−/−在测量荧光素酶活性之前24小时，用荧光素酶报告载体和表达野生型（pRC p53）或突变型p53蛋白（pRC 273H）的载体共转染细胞。
图2。
图2。
在应激和非应激条件下，p53增加GLS2转录。p53诱导GLS2 mRNA表达(A类)和蛋白质水平(B类)在32°C的V138/H1299细胞中，以及在使用Dox处理不同小时的LN-2024细胞中。通过实时PCR测定GLS2 mRNA水平，并用肌动蛋白标准化。用GLS2表达载体转染细胞的全细胞提取物检测外源性GLS2蛋白(B类，面板1）。线粒体提取物检测内源性GLS2蛋白(B类，面板2-4）。GLS2 siRNA寡核苷酸被用于敲低HepG2细胞内源性GLS2表达(B类，面板2）。NS：非特异性带。(C类和D类)IR（10 Gy）以p53依赖的方式诱导HCT116和HepG2细胞中GLS2 mRNA的水平。(E类)足叶乙甙（20μM）和H2O（运行）2（150μM）以p53依赖的方式诱导HCT116细胞中GLS2 mRNA水平。(F类)p53调节GLS2的基础表达水平。
图3。
图3。
GLS2表达增加细胞内谷氨酸和α-酮戊二酸的水平。(A类)外源性GLS2蛋白在GLS2表达载体转染细胞中的线粒体定位。线粒体用MitoTracker染色。(B类)外源性GLS2表达增加谷氨酸水平(左侧)而siRNA敲低GLS2（GLS2-siRNA）会降低细胞中的谷氨酸水平(赖特) (P（P）< 0.05). 转染后24小时测定谷氨酸水平。(C类) (左侧)外源性GLS2表达增加α-酮戊二酸水平。(赖特)GLS2敲除降低α-酮戊二酸水平(P（P）< 0.05). (D类和E类)p53增加细胞内谷氨酸和α-酮戊二酸的水平(P（P）< 0.05).
图4。
图4。
GLS2促进氧气消耗、线粒体呼吸和ATP生成。用GLS2表达载体或GLS2 siRNA寡核苷酸转染细胞。转染后24小时将细胞接种在96个平板中，接种后每2小时（0小时）测量一次耗氧量。(A类)外源性GLS2表达促进耗氧。(B类)GLS2击倒降低了耗氧量。(C类)p53增加细胞耗氧量。(D类)外源性GLS2表达增加细胞内ATP水平(P（P）< 0.05). (E类)GLS2敲除降低细胞内ATP水平(P（P）< 0.05). 转染后24小时测量ATP水平。
图5。
图5。
GLS2增加细胞内GSH和NADH的水平。在检测前24小时用GLS2表达载体或GLS2 siRNA转染细胞。(A类)外源性GLS2表达增加GSH水平和相对GSH/GSSG比率(P（P）< 0.05). (B类)GLS2敲除降低GSH水平和GSH/GSSH比率(P（P）< 0.05). (C类)外源性GLS2表达增加NADH水平，GLS2敲除降低NADH(P（P）< 0.05). (D类)p53增加GSH水平、GSH/GSSH比率和NADH水平(P（P）< 0.05). 用Dox处理LN-2024细胞24小时。
图6。
图6。
GLS2降低细胞内ROS水平并保护细胞免受H2O（运行）2-诱导细胞凋亡。用GLS2表达载体或siRNA寡核苷酸转染细胞24小时，然后用h2O（运行）2（400μM）在测量ROS前4小时或在测量凋亡前24小时。(A类)外源性GLS2表达降低细胞中ROS水平(P（P）< 0.05). (B类)GLS2敲低增加细胞中ROS水平(P（P）< 0.05). (C类)p53降低细胞内ROS水平(P（P）< 0.05). 用Dox处理LN-2024细胞24小时(D类)GLS2过表达保护细胞免受H2O（运行）2-诱导细胞凋亡(P（P）< 0.05). (E类)GLS2敲除使细胞对H敏感2O（运行）2-诱导细胞凋亡(P（P）< 0.05).
图7。
图7。
肝细胞癌中GLS2表达缺失和GLS2对肿瘤细胞集落形成的抑制。(A类)人肝细胞癌中GLS2 mRNA表达缺失或显著降低。肝细胞癌；N、 正常肝脏。肿瘤邻近组织：L1-5，肝硬化组织；L6–10，脂肪变化组织；L11-13，慢性肝炎组织。实时PCR检测GLS2的表达并用肌动蛋白归一化。N1的GLS2水平指定为1。样品由Origene Techonologies提供。P（P）<0.0001（正常vs.肿瘤），P（P）<0.0001（肿瘤邻近组织与肿瘤），以及P（P）=0.2367（正常组织与肿瘤邻近组织）。(B类)外源性GLS2表达减少肿瘤细胞（包括H1299、HepG2和HTB15细胞）中的细胞集落形成(P（P）< 0.05).
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