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.2010年4月；16(4):438-45.
doi:10.1038/nm.2121。 Epub 2010年3月28日。

磷脂酰肌醇3-激酶的一个调节亚单位增加X盒结合蛋白-1的核积累，以调节未折叠的蛋白质反应

乔纳森·温奈 1, 杰里米·鲍彻, 马塞洛·A·莫里, Kohjiro Ueki公司, C罗纳德·卡恩
附属公司

磷脂酰肌醇3-激酶的一个调节亚单位增加X盒结合蛋白-1的核积累，以调节未折叠的蛋白质反应

乔纳森·N·温奈等。 自然·医学. 2010年4月.

摘要

Ia类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是胰岛素代谢作用的重要介质，由催化（p110α或p110β）和调节（p85α、p85β或p55α）亚单位组成。在这里，我们显示p85alpha以内质网（ER）应激依赖的方式与未折叠蛋白反应（UPR）的转录介质X盒结合蛋白-1（XBP-1）相互作用。p85alpha基因敲除或敲除的细胞株显示出UPR的显著变化，包括内质网应激依赖性核XBP-1的积累减少，UPR靶基因的诱导减少，凋亡率增加。这与肌醇需要蛋白-1α（IRE1alpha）和转录因子-6alpha（ATF6alpha。肝中p85alpha缺失的小鼠（L-Pik3r1（-/-））在服用衣霉素后显示出类似的UPR减弱，导致炎症反应增加。因此，p85alpha在PI3K通路和细胞对内质网应激反应的调节之间形成了一种以前未被认识到的联系，PI3K途径是胰岛素作用的核心，而内质网紧张反应是一种无法解决的状态，导致胰岛素抵抗。

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数字

图1
图1
XBP-1作为p85α相互作用蛋白的鉴定和表征。a） 细菌双杂交筛选中使用的质粒示意图。a） （底部）XBP-1 cDNA和产生分别编码XBP-1u和XBP-1的开放阅读帧（ORF）1和2的替代剪接变体的示意图。b） 对单独转染HA-p85α或与FLAG-XBP-1u或FLAG-XBP-1s联合转染的细胞进行共免疫沉淀实验。抗HA免疫沉淀物通过SDS-PAGE进行解析，并用抗FLAG抗体进行免疫印迹。抗肌动蛋白免疫印迹证实，每种情况下使用相同的蛋白质。c） 用所示表达质粒瞬时转染HEK 293T细胞。转染48小时后，制备细胞溶质和核裂解物，随后使用抗FLAG抗体进行免疫印迹。d） 在转染或不转染FLAG-XBP-1s和增加HA-p85α表达质粒浓度的HEK293T细胞中评估FLAG-XBP-1s的核质穿梭。核和细胞质组分通过SDS-PAGE进行解析，并用抗FLAG或抗HA抗体进行免疫印迹。
图2
图2
p85α缺陷成纤维细胞内质网应激和UPR信号动力学的评估。a） 对细胞质和核蛋白组分进行免疫印迹，以评估在衣霉素（2μg ml）作用一段时间后BiP或XBP-1s蛋白的诱导作用−1)治疗。b） （顶部）控制和像素3r1−/−用指定浓度的衣霉素处理成纤维细胞5小时，并在全细胞裂解物上进行抗BiP免疫印迹。进行抗肌动蛋白免疫印迹以确保负载均匀。b） （底部）对来源于对照的cDNA进行定量RT-PCR像素3r1−/−用指定浓度的衣霉素处理成纤维细胞5小时。c） 控制和像素3r1−/−成纤维细胞用载体或衣霉素（2μg ml）处理−1)5小时后，使用IRE1α、pIRE1β和PERK特异性抗体对整个裂解物进行免疫印迹。进行抗肌动蛋白免疫印迹以确认蛋白质载量相等。d） 控制和像素3r1−/−用衣霉素（2μg ml）处理成纤维细胞−1)在指定的时间段内。使用XPB-1、ATF6和CHOP抗体对核裂解物进行免疫印迹分析。进行抗lamin A/C免疫印迹以确认等负荷。数据以平均值±SEM表示，星号表示学生t检验确定的统计显著性(*第页< 0.05, **第页<0.001，n.s.：无显著性）
图3
图3
评估XBP-1靶基因转录、UPR依赖性基因表达和凋亡。a） 进行定量PCR以确定UPR靶基因在像素3r1+/+或Pik3r1型−/−用载体或衣霉素处理细胞5小时。b） 细胞生长到汇合处，并在添加或不添加衣霉素（2μg ml−1)或塞普西格金（100 nM）24小时。收集漂浮和附着的细胞，将其与膜联蛋白V PE和碘化丙啶（PI）混合培养15分钟。然后进行FACS分析。测定凋亡细胞（PI阴性，膜联蛋白-PE阳性细胞）的百分比。数据是来自3个独立实验的平均值±S.E。c） 使用p85α特异性引物对对照和shp85α细胞系进行定量PCR。d） 使用由shGFP和经载体或衣霉素（2μg ml）处理的shp85α细胞系制备的全细胞裂解物进行免疫印迹分析−1)持续五个小时。e） 在用衣霉素（2μg ml）处理shGFP和shp85α细胞系之前或之后，进行定量PCR以量化BiP、Erdj4和Grp94 mRNA的表达−1)持续五个小时。数据以平均值±SEM表示，星号表示通过学生的t检验确定的统计显著性(*第页< 0.05; **第页< 0.001; n.s.=不重要）
图4
图4
对照组和L组肝脏UPR的评价-像素3r1−/−老鼠。八周大时，雄性像素3r1液氧/液氧或L-Pik3r1型−/−小鼠通过腹腔注射给药载体或衣霉素（2.5μg/g B.W.）。a） 之后72(n个=4个/组）或b）短时间服用衣霉素，收集肝脏并制备组织裂解物。在通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF后，使用所示抗体进行免疫印迹。进行肌动蛋白免疫印迹以确认蛋白质载量相等。c） 通过对来自对照组和L-像素3r1−/−小鼠用载药或衣霉素治疗4、8或12小时。引物被设计成侧翼从XBP-1转录本中切除的26 nt内含子。结果PCR产物用Pst I限制性内切酶消化并用琼脂糖凝胶电泳解析。
图5
图5
小鼠肝脏中基因表达、XBP-1剪接和XBP-1稳定性的分析像素3r1液氧/液氧和L-像素3r1−/−小鼠接受载药或衣霉素治疗72小时。(n个=5个/组）a）通过对来自像素3r1液氧/液氧和L-像素3r1−/−使用基因特异性引物的肝脏。b） 基于PCR的分析用于评估XBP-1剪接。c） 如前所述，通过定量PCR评估生理盐水和衣霉素处理（2.5μg/g BW）小鼠肝脏中的XBP-1剪接。d） 核裂解物像素3r1液氧/液氧和L-像素3r1−/−膜霉素（2.5μg/g BW）处理18小时后的小鼠通过SDS-PAGE分辨，并用XBP-1特异性抗体进行免疫印迹（上图）。使用Image J软件通过密度测定实现核XBP-1s蛋白的定量。数据以平均值±SEM表示，星号表示通过学生的t检验确定的统计显著性(*第页< 0.05; **第页<0.001)
图6
图6
对照组和L组的肝脏分析-像素3r1−/−衣霉素治疗后的小鼠。a） 通过对肝裂解物进行SDS-PAGE，然后用抗CHOP抗体进行免疫印迹来评估CHOP蛋白的表达。使用NIH Image J软件通过密度测定实现蛋白质定量。b） 控制和L的生命-像素3r1−/−小鼠用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片用苏木精和伊红染色。显示了具有代表性的图像。(n个=5个/组）c）通过对来自对照组和L组肝脏的cDNA进行定量PCR，测定CD68和TNFα的表达-像素3r1−/−小鼠给药载体或衣霉素（2μg/g体重）36小时后。数据以平均值±SEM表示，星号表示通过学生的t检验确定的统计显著性(*第页< 0.05)
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