Isoform-specific p73 knockout mice reveal a novel role for delta Np73 in the DNA damage response pathway

doi:10.1101/gad.1873910

.2010年3月15日；24(6):549-60.

doi:10.1101/gad.1873910。 Epub 2010年3月1日。

异构体特异性p73基因敲除小鼠揭示了δNp73在DNA损伤反应途径中的新作用

玛格丽塔·T·威廉¹, 亚历山德罗·鲁菲尼, 莫妮卡·韦策尔, 竹原胜也, 井上佐治, 理查德·托马西尼, 安妮克·伊蒂·尤滕, 安德鲁·韦克汉姆, 玛丽·阿塞纳-亨利克森, 格里·梅利诺, 大卫·R·卡普兰, 弗雷达·D·米勒, Tak W Mak公司

附属公司

PMID： 20194434
PMCID公司：项目经理2841333
内政部： 10.1101/gad.1873910

异构体特异性p73基因敲除小鼠揭示了δNp73在DNA损伤反应途径中的新作用

玛格丽塔·T·威廉等。基因开发. 2010.

.2010年3月15日；24(6):549-60.

doi:10.1101/gad.1873910。 Epub 2010年3月1日。

作者

玛格丽塔·T·威廉¹, 亚历山德罗·鲁菲尼, 莫妮卡·韦策尔, 竹原胜也, 井上佐治, 理查德·托马西尼, Annick Itie-Youten公司, 安德鲁·韦克汉姆, 玛丽·阿塞纳-亨利克森, 格里·梅利诺, 大卫·R·卡普兰, 弗雷达·D·米勒, Tak W Mak公司

附属

¹加拿大安大略省多伦多玛格丽特公主医院坎贝尔家族乳腺癌研究所。

PMID： 20194434
PMCID公司：项目经理2841333
内政部： 10.1101/gad.1873910

摘要

由于缺乏所有TAp73和DeltaNp73亚型，p73完全缺乏的小鼠有严重的神经和免疫缺陷。作为我们正在进行的区分这些亚型生物学功能的项目的一部分，我们培育了选择性缺乏DeltaNp73亚型的小鼠。缺乏DeltaNp73的小鼠（DeltaNp 73（-/-）小鼠）可以存活和繁殖，但表现出神经退化的迹象。DeltaNp73（-/-）小鼠的细胞对DNA损伤剂敏感，并显示p53依赖性凋亡增加。在分析DeltaNp73（-/-）细胞中的DNA损伤反应（DDR）时，我们发现DeltaNp 73在抑制从DNA断裂到DDR途径发出的分子信号方面具有全新的作用。我们发现DeltaNp73直接定位于DNA损伤部位，可以与DNA损伤传感器蛋白53BP1相互作用，并抑制ATM激活和随后的p53磷酸化。这一新发现可能解释为什么DeltaNp73高表达的人类肿瘤对化疗的耐药性增强。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
ΔNp73的缺失会降低大脑中的神经元密度。10个月龄野生型的大脑(n个=5）和ΔNp73^−/−(n个=4）对小鼠进行组织学分析。(一)10个月龄ΔNp73的典型Nissl染色冠状切片^−/−鼠标。框状区是指横跨胼胝体至软脑膜的皮质组织条，用于评估皮质厚度。(B类)皮层厚度定量。野生型和ΔNp73之间的皮质厚度没有差异^−/−10个月龄的小鼠。(C类,D类)神经元密度降低。小鼠皮层条带中的细胞密度一和B类通过Nissl染色进行组织学评估(C类)并被量化(D类)（ΔNp73^−/−每平方毫米1286±160.6个神经元，与野生型相比，每平方毫米1960±79.98个神经元）。中的结果D类是平均值±SEM(E类)浓缩细胞的频率增加。小鼠皮质条中的浓缩细胞一和B类计数（ΔNp73^−/−每平方毫米687.5±38.45个浓缩细胞，而野生型为每平方毫米538.6±15.14个浓缩细胞）。结果显示为平均值±SEM。

**图2。**
老化ΔNp73^−/−小鼠表现出神经退化的迹象。26至27岁的野生型大脑(n个=2）和ΔNp73^−/−(n个=2）对小鼠进行组织学分析。(一)26-27岁野生型和ΔNp73的典型Nissl染色冠状切片^−/−老鼠。与野生型相比，突变体的皮层厚度有所减少。(B类)皮层厚度定量。ΔNp73中检测到皮层厚度显著降低^−/−与野生型相比，26–27个月大的小鼠（ΔNp73^−/−，917±6.579毫米²，与野生型相比，1082±14.12 mm²). 中的结果B类是平均值±SEM(C类,D类)神经元密度降低。小鼠皮质条中的细胞密度一和B类通过Nissl染色进行组织学评估(C类)并被量化(D类)（ΔNp73^−/−每平方毫米1243±38.28个神经元，野生型2025±200个神经元）。结果如所示D类是平均值±SEM(E类)凝聚细胞的可比频率。小鼠皮质条中的浓缩细胞一和B类计数，但没有观察到显著差异。

**图3。**
ΔNp73的缺失增加了p53靶基因的表达，并增强了p53介导的凋亡。(一)p53靶基因mRNA表达增加。野生型或ΔNp73的主要MEF^−/−不治疗小鼠或用1μM阿霉素（DRB）治疗小鼠2 h，用定量PCR测定p21、Mdm2和Puma的mRNA表达水平。结果表明，与野生型相比，褶皱增加。(B类)p53靶基因蛋白表达增加。野生型或ΔNp73的主要MEF^−/−小鼠未经治疗或用1μM DRB治疗16 h，通过Western blotting测定p21和Mdm2的蛋白水平。肌动蛋白和微管蛋白用作负荷对照。(C类)细胞凋亡增强。野生型和ΔNp73^−/−用指定浓度的凋亡诱导剂处理MEF 24小时。通过Annexin V/PI染色和流式细胞术测定细胞活力。(D类)p53依赖性细胞凋亡增强。野生型胸腺细胞，ΔNp73^−/−，p53^−/−，或p53^−/−ΔNp73^−/−双KO（DKO）小鼠接受指定剂量的γ射线照射，16h后测定细胞凋亡C类.

**图4。**
ΔNp73的缺失会损害裸鼠的肿瘤形成。(一)肿瘤形成减少。E1A/拉斯^V12版本-转换野生型或ΔNp73^−/−将MEF皮下注射到无胸腺Balb/c nu/nu小鼠的两侧(n个=每组8个）。注射后2周评估肿瘤形成能力。(左侧小组）注射野生型或ΔNp73的代表性裸鼠的大体表现^−/−MEF公司。(赖特面板）显示野生型和ΔNp73的nu/nu小鼠肿瘤平均重量的直方图^−/−转化MEF（野生型，n个= 15; ΔNp73^−/−,n个= 11). 来自ΔNp73的肿瘤^−/−发现细胞明显小于来自野生型细胞的细胞（ΔNp73^−/−0.04克±0.016克，野生型0.4克±0.14克）。结果显示为平均值±SD。*P（P）*= 0.008. (B类)肿瘤动力学。E1A/Ras公司^V12版本-转换野生型或ΔNp73^−/−将MEF皮下注射到无胸腺Balb/c nu/nu小鼠的两侧(n个= 13). 在注射后20天内，以2-d的间隔评估肿瘤质量。来自ΔNp73的肿瘤^−/−细胞的生长速度明显慢于野生型细胞。结果显示为平均值±SEM。*P（P）*< 0.0001. (C类,D类)衰老标记表达增加。来自ΔNp73的肿瘤^−/−细胞显示SA-β-gal增加(C类)，第16页^{INK4A（墨水）}和DcR2(D类)与野生型细胞相比。结果代表了每个基因型的四种肿瘤。

**图5。**
DNA损伤后，ΔNp73缺陷细胞和组织中p53和ATM磷酸化和活化增加。(一)p53蛋白水平增加。野生型和ΔNp73^−/−用10μM顺铂处理MEF 16 h，Western blot分析p53蛋白。(B类,C类)p53Ser18和ATMSer1987磷酸化增加。野生型和ΔNp73^−/−MEF长期使用1μM DRB(B类)或短(C类)时间进程如图所示，用Western blot分析总的和磷酸化的p53和ATM。(D类)胸腺细胞中ATMSer1987磷酸化增加。野生型和ΔNp73^−/−胸腺细胞按指示接受γ射线照射，并通过Western blot评估总ATM水平和磷酸化ATM水平。(E类)皮肤组织中ATMSer1987磷酸化和γ-H2AX诱导增加。来自野生型和ΔNp73的皮肤组织^−/−按照指示对小鼠进行γ射线照射，并通过Western blot评估总ATM、磷酸化ATM和γ-H2AX蛋白水平。(F类)ΔNp73对DNA损伤的敏感性增加^−/−胸腺细胞依赖ATM。按照指示对所示基因型小鼠的胸腺细胞进行γ射线照射，16 h后通过Annexin V/PI染色和流式细胞术检测凋亡。DKO，ΔNp73^−/−自动取款机^−/−.老鼠。

**图6。**
ΔNp73干扰人类肿瘤细胞中ATM和p53的激活。(一)ΔNp73缺失时的细胞凋亡敏感性。用对照siRNA（黑条）或抗ΔNp73的siRNA（灰条）处理人骨肉瘤U2OS细胞24小时，然后再暴露于指定剂量的顺铂下24小时。Annexin V/PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡。(B类)在没有ΔNp73的情况下增加ATM激活。用对照siRNA或针对ΔNp73的siRNA处理U2OS细胞48 h，并在暴露于指示水平的γ射线后1 h通过Western blotting测定ATMSer1981和ATM/ATR底物的磷酸化水平。(C类,D类)ΔNp73β的过度表达会损害ATMSer1981磷酸化、p53蛋白积累和Puma表达。将体外表达ΔNp73β的U2OS细胞或模拟载体暴露于5Gyγ射线照射指定的时间，并检测其蛋白水平（1987年磷酸化-ATMSer）(C类)，或p53和Puma(D类)通过蛋白质印迹法测定。

**图7。**
ΔNp73与53BP1相互作用并定位于DNA损伤部位。(一)过表达的ΔNp73β与53BP1结合，而不是ΔNp 73α。用表达HA标记的ΔNp73α或ΔNp 73β的构建物瞬时转染U2OS细胞24小时，然后不处理或用5 Gyγ射线照射处理1小时。用抗53BP1抗体免疫沉淀细胞提取物，以检测每个ΔNp73亚型与内源性53BP1的结合。(B类)内源性ΔNp73与内源性53BP1结合。SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞未经治疗或接受5Gyγ射线照射指定时间。提取物用抗-*53制动踏板1*并受到西方印迹法的影响。γ射线照射后，ΔNp73和53BP1的共纯化作用减弱。(C类)PLA证实53BP1和ΔNp73β之间的相互作用是对DNA损伤的反应。用表达ΔNp73β的质粒转染盖玻片上生长的U2OS细胞。24小时后，将转染细胞置于未处理状态或接受5 Gyγ射线照射，孵育10分钟，固定并染色以检测53BP1:ΔNp73相互作用。共焦显微图像中的红点表明53BP1:ΔNp73相互作用阳性。细胞核用DAPI染色。(D类)DNA损伤灶内源性p73的检测。H1299细胞在盖玻片上生长，用2μM阿霉素处理，10分钟后固定。细胞用抗p73抗体（绿色）和抗体染色，以检测DNA损伤焦点标记物γ-H2AX（红色）。合并荧光显示p73与γ-H2AX共定位，DNA损伤集中于DNA损伤。(E类)DNA损伤灶内源性ΔNp73的检测。SH-SY5Y细胞在盖玻片上生长，经5 Gyγ射线照射处理，10min后固定。细胞用抗ΔNp73抗体（红色）和抗体染色，检测DNA损伤焦点标记物γ-H2AX（绿色）。合并荧光显示，ΔNp73与γ-H2AX共定位，γ射线照射引起DNA损伤。(F类)确认ΔNp73与DNA损伤灶共定位的siRNA敲除。将表达对照siRNA或抗ΔNp73 siRNA的U2OS细胞培养48 h。然后将细胞置于未处理状态或用5 Gyγ射线照射处理，10 min后固定，并进行免疫染色以检测53BP1和p53。共聚焦显微镜显示，ΔNp73的缺失增加了53BP1（绿色）和p53（红色）在DNA损伤部位的募集和共定位。

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中的注释

{三角洲}Np73{beta}阻止DNA修复。
Vernersson-Lindahl E，Mills AA。 Vernersson-Lindahl E等人。基因开发，2010年3月15日；24(6):517-20. doi:10.1101/gad.1914210。基因开发，2010年。 PMID：20231313 免费PMC文章。

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