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.2010年2月22日；188(4):527-36.
doi:10.1083/jcb.200911154。 Epub 2010年2月15日。

Acb1的非常规分泌由自噬体介导

胡安·杜兰 1, 克里斯托夫·安贾德, 克里斯·斯特凡, 威廉·F·卢米斯, 维瓦卡·马霍塔
附属公司

Acb1的非常规分泌由自噬体介导

胡安·杜兰等。 J细胞生物学. .

摘要

饥饿的盘基网柄菌细胞分泌AcbA，这是一种酰基辅酶A结合蛋白（ACBP），缺乏进入内质网（ER）的常规信号序列。盘状芽孢杆菌分泌AcbA需要高尔基相关蛋白GRASP。在本研究中，我们报告了饥饿诱导的Acb1分泌，即酿酒酵母ACBP同源物，也需要GRASP（Grh1）。这突出了GRASP在非常规分泌中的保守功能。虽然ER到高尔基体或高尔基体到细胞表面转运所需的基因在酵母中不需要Acb1分泌，但这一过程涉及自噬基因和质膜t-SNARE，Sso1。抑制向液泡的转运并不影响Acb1的分泌。总之，我们的实验揭示了一种独特的分泌途径，其中含有Acb1的自噬体逃避与液泡融合，以防止货物降解。我们建议，这些自噬体中间产物与再循环的内体融合，形成多泡体载体，然后与质膜融合释放货物。

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图1。
图1。
酵母释放SDF-2类物质。（A） 中AcbA同源物的氨基酸序列面包酵母,盘状D、和智人对齐。（B） Acb1活性测定。酵母细胞在指定的时间内处于饥饿状态。通过低速离心将细胞从培养基中分离出来并进行裂解。裂解产物用于检测Acb1和控制蛋白3-磷酸甘油酸激酶（Pgk1）的细胞内水平。对培养基进行处理以浓缩Acb1活性，然后测试其产孢能力D。 盘状体KP细胞并量化。（C） 将发育好的KP细胞与酵母饥饿4小时的缓冲液孵育，1小时后计数孢子数量。（D） 通过用抗Pgk1p（3-磷酸甘油酸激酶）抗体和抗Acb1对酵母细胞裂解物进行蛋白质印迹来评估蛋白质水平，所述抗体是用作对照的胞浆蛋白。抗-Flag抗体显示Acb1-Flag标记版本的表达。（E） 分泌的时间进程。酵母细胞处于饥饿状态，每30分钟取样一次，直到4小时。对缓冲液进行SDF-2样活性分析。数据显示平均有三个实验。
图2。
图2。
Acb1分泌需要GRASP。（A） 野生型和grh1Δ酵母在饥饿缓冲液中培养0、1、4和16小时，并在生物测定中测试上清液。（B） 将野生型和bug1Δ酵母饥饿4 h，并在生物测定中分析上清液。（C） 表达GFP标记的Grh1版本的野生型菌株被饥饿4小时，并通过荧光显微镜观察。饥饿不会改变Grh1定位的点状模式。棒，5µm。（D） 细胞按A处理，分析细胞裂解物以监测各自的蛋白质水平。Grh1的缺失不会影响细胞内3-磷酸甘油酸激酶或Acb1的水平。数据显示平均有三个实验。
图3。
图3。
Acb1分泌不需要传统的分泌途径。（A） 酵母在25°C的富培养基中生长，洗涤，并在允许温度（25°C）或限制温度（37°C）的醋酸盐缓冲液中饥饿4 h。在生物测定中测定了SDF-2样活性。数据显示平均有三个实验。（B） 对A细胞进行裂解，并用抗Pgk1和抗Acb1抗体进行蛋白质印迹，以监测在允许和非允许温度下的蛋白质水平。
图4。
图4。
分泌Acb1需要自噬基因。（A） 删除atg基因5、7、8和12的酵母突变体在饥饿培养基中培养4小时。在生物测定中测试缓冲液。数据显示平均有三个实验。（B） 用抗Acb1抗体对A中描述的细胞进行蛋白质印迹。Atg突变体在Acb1的细胞内水平没有任何变化。（C） 野生型酵母grh1Δ和atg7Δ在其内源性启动子的控制下，用表达GFP-Atg8的质粒转化。与A.中一样，细胞处于饥饿状态。野生型和grh1Δ菌株在液泡室中显示GFP荧光。然而，由于自噬缺陷，atg7Δ菌株在液泡中缺乏GFP荧光。棒材，5µm。（D） 将表达GFP-Atg8的野生型、grh1Δ和atg7Δ细胞饥饿4 h，用抗GFP抗体对细胞裂解液进行Western blot，以监测GFP-Atg 8的空泡蛋白水解。野生型和grh1Δ细胞，而不是atg7Δ细胞，显示出较低的条带，其表观分子量仅为GFP，这是由液泡蛋白酶对GFP-Atg8的蛋白水解引起的（Shintani和Klionsky，2004）。
图5。
图5。
Acb1分泌需要早期内体和MVB成分。（A） 将所示基因的野生型和缺失突变体饥饿4小时，并在生物测定中测定缓冲液中的SDF-2样活性。数据显示平均有三个实验。（B） 对来自A的酵母进行裂解，并用抗Pgk1和抗Acb1抗体对等量的酵母进行Western blot。将缺失突变体与其野生型等基因菌株（BY4741或SEY6210）进行比较。在本实验中测试的酵母突变体中，Acb1的细胞内水平不受影响。
图6。
图6。
Acb1分泌途径。细胞质Acb1被包装成自噬体，与早期内体融合。含有Acb1的早期内体要么直接与细胞表面融合，要么更可能成熟为MVB。MVB与细胞表面融合，释放含有Acb1的外泌体。Grh1是Acb1分泌所必需的，必须是膜相关的，才能在这一途径中发挥作用。然而，Grh1在非常规分泌中的确切作用部位尚不清楚。
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中的注释

  • 自噬体胞吐导致的非常规分泌。
    菲弗SR。 菲弗SR。 细胞生物学杂志。2010年2月22日；188(4):451-2. doi:10.1083/jcb.201001121。Epub 2010年2月15日。 细胞生物学杂志。2010 PMID：20156968 免费PMC文章。

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