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.2010年2月；9(2):336-46.
doi:10.1158/1535-7163.MCT-09-0589。 Epub 2010年2月2日。

前列腺癌细胞中Kelch-like ECH-associated protein 1功能的丧失会导致化疗耐药和放射耐药，并促进肿瘤生长

张萍（Ping Zhang） 1, 安居·辛格, Srinivasan Yegnasubramanian语, 大卫·埃索比, 蓬维亚·孔巴拉朱（Ponvijay Kombairaju）, 曼尼什·博达斯, 吴海龙, 史蒂文·G·博瓦, 希亚姆·比斯瓦尔
附属公司

前列腺癌细胞中Kelch样ECH相关蛋白1功能的丧失导致化学耐药性和放射耐药性，并促进肿瘤生长

张萍（Ping Zhang）等人。 摩尔癌症治疗. 2010年2月.

摘要

核因子-红细胞-2-相关因子2（Nrf2）抑制剂Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）的功能丧失突变导致非小细胞肺癌中Nrf2活性增加，并产生治疗耐药性。我们检测到Keap1基因的点突变，导致前列腺癌细胞中非保守氨基酸替换。我们在DU-145细胞中发现了Keap1失活的新转录和转录后机制，如启动子CpG岛超甲基化和Keap1异常剪接。在DU-145细胞中检测到极低水平的Keap1 mRNA，使用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂脱氧胞苷处理后显著增加。Keap1功能的丧失导致Nrf2及其下游电泳/药物解毒途径的活性增强。通过RNA干扰抑制DU-145细胞中Nrf2的表达，可减弱谷胱甘肽、硫氧还蛋白的表达，以及与对抗电泳物、氧化应激和广泛药物解毒有关的药物流出途径。组成性表达Nrf2短发夹RNA的DU-145细胞总谷胱甘肽水平较低，细胞内活性氧水平较高。DU-145细胞中Nrf2功能的减弱增强了对化疗药物的敏感性和辐射诱导的细胞死亡。此外，Nrf2的抑制大大抑制了DU-145前列腺癌细胞的体内外肿瘤生长。因此，以前列腺癌细胞中的Nrf2通路为靶点可能提供一种新的策略，以增强化疗和放疗的反应性，改善生长和致瘤性，从而改善临床结果。

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数字

图1
图1。前列腺癌细胞系中Keap1突变
（A）在CWR22Rv1细胞系Keap1的外显子3中检测到杂合C–T转换突变，导致酪氨酸到苏氨酸的替代。在LNCaP和C42B细胞中，发现Keap1外显子3的杂合C–T转换突变导致苏氨酸到蛋氨酸的替代。显示的野生型（WT）序列是从PrEC获得的。C42B和LNCaP细胞中的Keap1突变是相同的（数据未显示）。（B）在LNCaP和CWR22Rv1中检测到显示氨基酸变化位置的多个蛋白质序列比对。
图2
图2。前列腺癌细胞Keap1-Nrf2通路失调
（A）前列腺癌细胞中Keap1和Nrf2表达的实时RT-PCR分析。PC3细胞中的表达水平任意取值为1。柱，平均值(n个= 3);酒吧，标准偏差。（B）前列腺癌细胞中Keap1-Nrf2的Western blot分析。核蛋白免疫印迹显示DU-145细胞和其他前列腺癌细胞中Nrf2水平升高。为了检测Keap1的表达，加载等量的全细胞提取物。GADPH和层粘连蛋白B被用作正常对照（C）前列腺癌细胞中Nrf2靶基因、HO1、NQO1、Gclc和GSR的实时RT-PCR分析。PC3中的表达水平任意取值为1。柱，平均值(n个= 3);酒吧，标准偏差。
图3
图3。启动子CpG二核苷酸甲基化和mRNA差异剪接均导致DU-145细胞Keap1表达降低
（A）DU-145细胞、人类外周血白细胞和PrEC细胞中Keap1启动子处5-mCpG亚硫酸氢钠序列的示意图。每个圆圈代表一个单独的CpG站点。闭合圈，甲基化CpG位点；开放的圈子，非甲基化的场所。显示了每个扩增子相对于最长Keap1亚型TSS的开始和结束。PrEC基因组DNA中从-393到-93的区域包含许多非形成性CpG二核苷酸，尽管非CpG转化率很高，但与公认的亚硫酸氢转化序列存在偏差。（B）左面板实时RT-PCR分析Keap1、NQO1和Gclm表达。右图，全长Keap1转录物的扩增。PCR产物在琼脂糖凝胶上溶解。（C）前列腺癌细胞中全长keap1转录物的扩增（左图）和keap1野生型转录物和DU-145衍生的选择性剪接产物的示意图（右图）。E2到E6代表外显子2到外显子6的相对位置，开盒代表5′和3′非翻译区。（D）非功能性截短Keap1蛋白的异常剪接Keap1转录物编码。将克隆在pDNA3.1表达载体中的WT和差异剪接的Keap1转录物转染到DU-145细胞中，并通过免疫印迹分析测量Keap1蛋白的表达（左图）。截短的Keap1蛋白无法抑制Nrf2依赖的NQO1报告活性。（右侧面板）。
图4
图4。组成性表达Nrf2shRNA的DU145细胞的制备与鉴定
（A）通过免疫印迹和实时RT-PCR筛选稳定表达Nrf2shRNA的DU-145细胞克隆。（B）稳定表达Nrf2shRNA的DU-145细胞中Nrf2及其下游靶基因的基因表达分析。选择Nrf2sh RNA克隆#2进行进一步研究。DU-145-Luc-shRNA的表达水平被任意定为1。（C）DU-145细胞总谷胱甘肽水平降低，Nrf2表达降低。（D）与表达Luc-shRNA的细胞相比，表达Nrf2-shRNA细胞的内源性ROS水平更高（左图）。NAC（15μM）预处理30分钟后，ROS水平降低（右侧面板）*P（P）<0.05.
图5
图5。降低DU-145细胞中Nrf2的表达可增强化疗药物和电离辐射的疗效
（A）增强DU145-Nrf2shRNA细胞对紫杉醇、顺铂和足叶乙甙的敏感性。细胞暴露于药物48至72小时，并通过MTS分析测定活细胞。细胞存活率表示为相对于未处理对照组的吸光度。结果以平均值±SD表示。（B）增强Nrf2缺失的Du145-Nrf2shRNA细胞中放射性标记紫杉醇的积累。“*”，P（P）<0.05.（C）稳定表达NRF2shRNA的DU-145细胞的克隆形成存活。表达非靶向LucshRNA的细胞作为对照。
图6
图6。DU-145细胞中Nrf2的抑制降低了细胞增殖在体外减少肿瘤生长体内
（A）NRF2促进前列腺癌细胞增殖。将5万个细胞接种在6孔板的每个孔中，连续5天每天测量相对细胞数*P（P）<0.001。（B）将DU-145-LucshRNA和DU-145-Nrf2shRNA细胞注射到雄性裸鼠的侧翼(n个LucshRNA细胞组为13；n个Nrf2sRNA组为12）。每周测量肿瘤大小，持续5周，并计算平均肿瘤体积。实验结束时记录肿瘤重量。使用2样本Wilcoxon秩和检验分析数据（*U=424-604，P（P）-值<0.001）。
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