EGF-induced ERK activation promotes CK2-mediated disassociation of alpha-Catenin from beta-Catenin and transactivation of beta-Catenin

doi:10.1016/j.molcel.2009.09.034

.2009年11月25日；36(4):547-59.

doi:10.1016/j.molcel.2009.09.034。

EGF诱导的ERK激活促进CK2介导的α-连环蛋白与β-连环素的解离和β-连环素的反式激活

海涛记¹, Ji Wang（音译）, 亨茨·尼卡, 大卫·霍克, 苏珊·基泽, 清远阁, 冰凉坊, 方学勋, 德兴方, 大卫·W·利奇菲尔德, 肯尼斯·阿尔达佩, 卢志敏

附属公司

PMID： 19941816
预防性维修识别码：项目经理2784926
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2009.09.034

EGF诱导的ERK激活促进CK2介导的α-连环蛋白与β-连环素的解离和β-连环素的反式激活

海涛记等。分子电池. 2009.

.2009年11月25日；36(4):547-59.

doi:10.1016/j.molcel.2009.09.034。

作者

海涛记¹, Ji Wang（音译）, 亨茨·尼卡, 大卫·霍克, 苏珊·基泽, 清远阁, 冰凉坊, 方学训, 方德兴, 大卫·W·利奇菲尔德, 肯尼斯·阿尔达佩, 卢志敏

附属

¹德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心脑瘤中心和神经病学系，美国休斯顿，77030。

PMID： 19941816
预防性维修识别码：项目经理2784926
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2009.09.034

摘要

在许多类型的人类癌症中检测到Wnt/Wingless依赖或非依赖信号导致β-catenin转录活性增加，但Wnt-independent调节的潜在机制尚不清楚。我们在这里证明，EGFR激活导致β-连环蛋白和α-连环素复合体的破坏，从而通过S641α-连环素的CK2alpha依赖性磷酸化消除α-连链蛋白对β-连环蛋白反式激活的抑制作用。ERK2被EGFR信号激活，通过ERK2对接沟直接与CK2alpha结合，并主要在T360/S362磷酸化CK2alph，随后增强CK2alha活性以实现α-钙蛋白磷酸化。此外，α-catenin S641磷酸化水平与人脑胶质母细胞瘤标本中ERK1/2活性水平以及胶质瘤恶性程度相关。这种EGFR-ERK-CK2介导的α-钙调素磷酸化促进β-连环素反式激活和肿瘤细胞侵袭。这些发现突出了EGFR和Wnt通路之间的串扰在肿瘤发展中的重要性。

PubMed免责声明

数字

**图1。EGFR激活导致β-连环蛋白和α-连环素复合物的破坏并促进β-连环素的反激活**
（A，B）α-连环蛋白免疫沉淀后用β-连环素抗体进行免疫印迹。（A）在指定的时间内用EGF（100 ng/ml）处理指定的细胞系。（B）用EGF（100 ng/ml）处理6小时的A431细胞制备亚细胞组分。用EGF处理10或24小时（C）或6小时（D）的未（C）转染FLAG-α-catenin或（D）转染的（C，D）A431细胞，并用所示抗体进行免疫染色。（E）从表达EGFR的293T细胞中制备核组分（左面板）或总细胞裂解物（右面板），分别含有或不含有FLAG-α-catenin。用EGF（100 ng/ml）处理细胞6小时，并用所示抗体进行免疫印迹。（F，H）用EGF（100 ng/ml）处理细胞8小时后，测定荧光素酶活性。荧光素素酶活性的相对水平归一化为未处理细胞的水平和Renilla控制质粒的荧光素酶活性水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。（F）将pCep4-EGFR与TOP-FLASH或FOP-FLASH联合转染293T细胞，转染时加入或不加入FLAG-α-catenin。（G） A431细胞用对照shRNA或α-catenin shRNA稳定表达。用指示的抗体进行免疫印迹分析。（H）将TOP-FLASH或FOP-FLASH转染到用对照shRNA或α-连环蛋白shRNA稳定表达的A431细胞中。

**图2。CK2α在S641与α-catenin相互作用并使其磷酸化**
（B-E）使用所示抗体进行免疫印迹分析。（A）用质谱法分析EGF刺激的A431细胞的α-catenin免疫沉淀。胰蛋白酶片段634-TPEELDDSDFETEDFDVR-651的质谱分析表明S641被磷酸化。y-11和y-10之间的m/z差异与phospho-Ser相匹配。（B）用纯化的细菌表达的WT His-α-catenin或His-β-cateninS641A进行体外激酶分析，其中含有或不含有CK2α。（C） pRc/CMV2-HA-CK2α与pEGFP N1-FLAG标记的WTα-catenin或α-catentin S641A突变体共同转染293T细胞。用抗α-连环蛋白Ser641抗体对免疫沉淀的FLAG标记的α-连环蛋白进行免疫印迹。（D）从用EGF（100 ng/ml）处理30分钟的A431细胞制备亚细胞分级。（E）用或不用EGF（100 ng/ml）处理表达FLAG标记的WTα-连环蛋白的A431细胞1或3小时。免疫沉淀CK2α。（F） A431细胞表达或不表达*CK2型*αshRNA或对照shRNA用或不用EGF（100 ng/ml）处理30分钟。

**图3。CK2α介导的S641α-catenin磷酸化释放α-catelin与α-caterin结合**
用所示抗体进行免疫沉淀和免疫印迹分析。（A）用纯化的细菌表达的WT His-α-catenin（含或不含CK2α）进行体外激酶分析，然后用GST（对照）或GST-α-catanin谷胱甘肽-甘露糖珠进行GST下拉分析。（B）将FLAG标记的α-catenin与pRc/CMV2-HA-CK2α或pRc/CMC2-HA-CK2αK68M共转染293T细胞。（C）用或不用EGF（100 ng/ml）处理表达CK2αshRNA的A431细胞2小时。（D）将标记有FLAG的WTα-catenin、α-catening S641A或α-catentin S641D突变体转染到293T细胞中。用抗FLAG抗体对总细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用所示抗体进行免疫印迹分析。（E）将FLAG标记的WTα-catenin、α-catentin S641A或α-catening S641D突变体转染至293T细胞。用所示抗体对膜或细胞核部分进行免疫沉淀。

**图4。ERK1/2磷酸化CK2α并增强CK2α向α-catenin的活性以响应EGF刺激**
用所示抗体进行免疫沉淀和免疫印迹分析。（A）体外将纯化的ERK2或ERK5与煮沸的CK2α混合进行激酶分析。（B）体外将纯化的ERK2与煮沸的CK2α、CK2αT360A、CK2βS362A或T360/S362A突变体混合进行激酶分析。（C）用FLAG标记的WT CK2α或CK2αT360/S362A代谢标记表达MEK1 Q56P和ERK2的293T细胞³²磷酸化12小时。用抗FLAG抗体进行免疫沉淀。（D）在激酶分析中，将纯化的CK2α（含或不含纯化的His-α-catenin）（左面板）或HDAC3（右面板）与纯化的ERK2混合。图像通过扫描密度计进行量化。（E）体外通过将未煮沸的WT CK2α或CK2αK68M与纯化的ERK2混合或不混合进行激酶分析。（F，G）MEK1 Q56P与WT ERK2或ERK2 K52R激酶缺失突变体以及WTα-catenin或α-catentin S641A共同转染293T细胞。在收获前，将细胞在不含（F）或含TBB（40μM）（G）的情况下处理6小时。（H）在EGF（100 ng/ml）刺激30 min之前，用U0126（25μM）或TBB（40μM）预处理A431或U373细胞30 min。

**图5。ERK2通过对接槽直接与CK2α结合**
用所示抗体进行免疫沉淀和免疫印迹分析。（A）将固定化纯化的His-CK2α与纯化的ERK2混合，然后用细胞裂解缓冲液和免疫印迹分析洗涤三次。对照，镍-大蒜珠。（B）用表达MEK1 Q56P和FLAG-ERK2的一个或多个对照载体转染293T细胞。（C）将表达MEK1 Q56P的载体与FLAG-WT ERK2、FLAG-ERK2 T/E（T157/158E）、FLAG-ERK2 D/N（D316/319N）或FLAG-ERK 2 T/E-D/N突变体共同转染到293T细胞中。

**图6。EGF诱导的ERK2激活通过增强S641处CK2-磷酸化α-连环蛋白促进β-连环素转激活和肿瘤细胞侵袭**
（A-D）荧光素酶活性的相对水平归一化为未处理细胞的水平和Renilla控制质粒的荧光素酶活性水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差。（A） TOP-FLASH或FOP-FLASH与指示质粒或不带指示质粒共同转染293T细胞。（B）将表达MEK1 Q56P和ERK2的载体与TOP-FLASH或FOP-FLASH共转染293T细胞。细胞在收获前用TBB（40μM）预处理6小时。（C）将表达EGFR的载体与TOP-FLASH或FOP-FLASH共同转染到293T细胞中。用TBB（40μM）、芹菜素（40μM）、U0126（25μM）或PD98059（30μM）预处理细胞30分钟，然后EGF（100 ng/ml）持续6小时。（D）TOP-FLASH或FOP-FLASH-与表达FLAG-tagged WTα-catenin、α-catening S641A或α-cateni S641D的载体共转染A431细胞。用EGF（100 ng/ml）处理细胞8小时。用指示的抗体进行免疫印迹（左上面板）。（E，F）用对照shRNA或CK2αshRNA（E）表达的A431细胞池，或用载体FLAG-tagged WTα-catenin、α-catening S641A或α-cateni S641D（F）稳定转染的A431电池池，在无EGF或有EGF（100 ng/ml）的情况下，在Matrigel的顶面进行电镀。电镀后一天，迁移到插入物另一侧的细胞被结晶紫染色。显示了代表性的显微照片（左侧面板）。将带有入侵细胞的膜溶解在4%脱氧胆酸中，并在590 nm处比色读取，以量化入侵。数据表示三个独立实验的平均值±标准偏差（右侧面板）。用指示的抗体进行免疫印迹（右上面板）。

**图7。α-连环蛋白S641磷酸化水平与人GBM中ERK1/2活性水平及胶质瘤恶性程度相关**
（A）对46例GBM标本进行抗磷酸-ERK1/2和抗磷酸-α-catenin S641A抗体免疫组化染色。展示了四个肿瘤的代表性照片。（B）组织切片上的免疫组织化学染色按照材料和方法中的描述进行半定量评分（皮尔逊积矩相关检验r=0.76；p<0.0001）。请注意，图表上的一些点表示多个样本（一些分数重叠）。（C）用抗磷酸化-α-连环蛋白S641抗体对23例弥漫性星形细胞瘤标本进行免疫组织化学染色，并与46例GBM标本的染色进行比较分析（学生的t吨测试，双尾，p<0.00001）。数据表示样本得分的平均值±标准偏差。

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