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.2009年12月17日；114(26):5315-21.
doi:10.1182/bloud-2009-02-204362。 Epub 2009年10月23日。

BCL6通过抑制SYK磷酸酶PTPROt调节弥漫性大B细胞淋巴瘤的BCR信号通路

Przemyslaw Juszczynski公司 1, 陈林峰, 埃文·奥唐纳, 何塞·M·波罗, 斯特拉·兰库洛, 里卡多·达拉·费弗拉, 阿里·梅尔尼克, 玛格丽特·夏普
附属公司

BCL6通过抑制SYK磷酸酶PTPROt调节弥漫性大B细胞淋巴瘤的BCR信号通路

Przemyslaw Juszczynski公司等人。 血液. .

摘要

张力B细胞受体（BCR）信号传导是正常B细胞个体发生和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）亚群中的一个关键生存途径。我们之前证明，BCR-依赖性DLBCL细胞系和原发肿瘤在使用BCR-相关脾酪氨酸激酶（SYK）的ATP-竞争性抑制剂治疗后发生凋亡。这些“BCR型”肿瘤也有更丰富的转录阻遏物BCL6的表达，并增加了对BCL6抑制的敏感性。在此，我们评估了BCL6介导的转录抑制和SYK依赖的BCR信号之间的潜在联系。在转录分析的正常B细胞亚群（幼稚、生发中心和记忆B细胞）和原发性DLBCL中，BCL6和SYK酪氨酸磷酸酶PTPROt的表达模式相互交替。BCL6通过与PTPROt启动子中功能性BCL6结合位点的直接相互作用抑制PTPROt转录。正常原始B细胞中BCL6的强制表达和生殖中心B细胞中RNAi介导的BCL6缺失直接调节PTPROt的表达。在“BCR型”DLBCL中，BCL6缺失增加了PTPROt的表达，降低了SYK和下游衔接蛋白BLNK的磷酸化。由于BCL6增强BCR信号传导，而BCL6和SYK在许多DLBCL中都是有希望的治疗靶点，因此对这些功能相关通路的联合抑制值得进一步研究。

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图1
图1
正常B细胞和原代DLBCL中PTPROt和BCL6表达的相互模式（A）2个独立系列的高度纯化的正常B细胞（幼稚的GC成中心细胞[CB]和中心细胞[CC]，记忆）中的相对BCL6和PTPROt转录物丰度。（B） 176例新诊断和先前分析的DLBCL中BCL6和PTPROt转录物的相对丰度。同时分析的正常GC B细胞被纳入比较（左）。主DLBCL和正常GC单元的综合集群名称显示在热图上方。主要DLBCL系列包括77个BCR、50个OxPhos和49个HR肿瘤。底部的色标表示相对表达式和平均值的SD。红色意味着高级表达；蓝色表示低级表达
图2
图2
PTPROt转录受BCL6调节（A）BCL6以剂量依赖的方式抑制PTPROt启动子驱动的转录；将350 ng PTPROt启动子荧光素酶报告子构建物（pGL3-Luc-PTPROt−1108+381）与空载体或增加剂量（5-100 ng）的BCL6表达载体（pMT2T-HA-BCL6）共同转染到HEK293T细胞中。如前所述评估荧光素酶活性（见“荧光素酶分析”）。（B） WT-BCL6而非BCL6突变体抑制PTPROt启动子驱动的转录。pGL3-Luc-PTPROt-1103+381与编码HA-BCL6或2个BCL6突变体中的1个突变体的100 ng载体共转染，缺失氨基末端转录抑制域（BCL6-ZF）或羧基末端DNA结合锌指结构域（BCL-6-ΔZF），随后测定荧光素酶活性。在面板A和B中，来自3个独立实验的代表性荧光素酶活性被归一化为Renilla荧光素酶活性，并表示为折叠变化±SD。
图3
图3
BCL6通过与PTPROt公司启动子区.（A）BCL6绑定到PTPROt公司体内启动子。以BCL6抗体或正常IgG为对照，对2株DLBCL细胞系（DHL4和DHL6）进行染色质免疫沉淀。中的目标放大器PTPROt公司启动子包括3个预测的BCL6结合位点（BS1-3，■）和2个远端上游或下游控制区（C1和C2，□）。计算每个区域的BCL6/IgG比值，并将其归一化为控制区1。（B） BCL6介导的抑制PTPROt公司启动子需要完整的BCL6结合位点。PTPROt-启动子驱动的荧光素酶构建物在预测的BCL6结合位点中有或无单独或联合突变，与pMT2T-HA-BCL6共同转染到HEK293T细胞中。随后测定荧光素酶活性。
图4
图4
BCL6调节正常原始B细胞、GC成中心细胞和某些DLBCL中PTPROt的表达.（A）正常B细胞。用eGFP-BCL6构建物或空载体转染正常的原始B细胞（左），用BCL6-shRNA慢病毒载体或打乱对照转染GC成中心细胞（右）。（B） DLBCL。用BCL6 siRNA转导DLBCL细胞系（DHL4）。在正常B细胞（A）和DLBCL电池系（B）中，用Western blot（顶面板）检测BCL6蛋白水平，用RT-PCR（底面板）检测PTPROt表达。在DLBCL中，还评估了总SYK、上游BCR通路成分CD79a和下游适配蛋白BLNK的表达水平。误差条表示代表性实验中每个条件和细胞类型的3个独立RT-PCR分析的平均值中的SD。
图5
图5
PTPROt过度表达抑制SYK Y352酪氨酸磷酸化Tet-inducible Flag-tagged WT或突变体（CS）PTPROt克隆在有或无Dox的情况下培养，并用山羊抗人IgG刺激5分钟（A）、15分钟（B）或不处理。随后，用抗SYK或抗CD79a抗体对细胞进行裂解和免疫沉淀。对免疫沉淀物进行分级、印迹，并用指示的磷酸酪氨酸抗体（分别为抗pSYK352、-pSYK525/526、-pSYK323和4G10）进行分析。随后剥离印迹并用抗泛SYK或抗CD79a抗体进行印迹。在每个实验中，同时对相应的全细胞裂解物进行大小分级、印迹和Flag抗体分析，以确认Dox诱导的WT-PTPROt或CS-PTPROt过度表达。
图6
图6
BCL6介导的PTPROt抑制增加紧张性BCR信号DLBCL细胞系DHL4被BCL6-siRNA、SCR对照寡核苷酸转导，或未经处理。随后将细胞培养72小时，并用山羊抗人IgG（10μg/mL）刺激1分钟或不处理。（A） BCL6缺失后SYK磷酸化的西方分析。BCR-交联细胞被裂解并用抗SYK免疫沉淀。免疫沉淀物进行分级、印迹，然后用α-pSYK Y352抗体进行分析。随后将膜剥离并用抗泛SYK抗体进行印迹。（B） BCL6缺失后补体和α-Ig诱导的SYK Y352和BLNK Y84磷酸化的磷酸特异性流式细胞术分析。在BCL6-siRNA（红色）、SCR控制寡核苷酸（蓝色）或未经处理（绿色）的BCR交联缺失（左侧面板）或存在（右侧面板）的情况下，比较转导细胞中的SYK Y352和BLNK Y84磷酸化（顶部和底部面板）。用同型匹配的对照Ig染色的细胞也显示出来（灰色虚线）。x轴表示表达式（对数刻度），y轴表示单元数。
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