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.2009年6月12日；137(6):1062-75.
doi:10.1016/j.cell.2009.03.048。

自噬通过消除p62抑制肿瘤发生

罗宾·马修 1, 克里斯蒂娜·M·卡普, 布莱恩·博登, Nhan Vuong公司, 陈光华, 陈心怡, 凯文·布瑞, 阿努帕马·雷迪, 吉安·巴诺特, 赛琳·吉利纳斯, 罗伯特·S·迪帕拉, 瓦西里基·卡兰扎·沃德沃思, 艾琳·怀特
附属公司

自噬通过消除p62抑制肿瘤发生

罗宾·马修等。 单元格. .

勘误表in

  • 细胞。2011年4月15日；145(2):322

摘要

基本自噬基因beclin1的等位基因丢失发生在人类癌症中，并使小鼠容易发生肿瘤，这表明自噬是一种肿瘤抑制机制。虽然肿瘤细胞利用自噬来抵抗代谢应激，但自噬也减轻了可能限制肿瘤发生的细胞损伤。为了应对压力，自噬缺陷的肿瘤细胞优先积累p62/SQSTM1（p62）、内质网（ER）伴侣、受损线粒体、活性氧（ROS）和基因组损伤。此外，抑制ROS或p62积累可防止自噬缺陷导致的损伤，这表明未能调节p62会导致氧化应激。重要的是，自噬缺陷导致的p62持续表达足以改变NF-kappaB调节和基因表达，并促进肿瘤发生。因此，缺陷自噬是人类肿瘤中常见的p62上调机制，可能通过干扰对肿瘤发生至关重要的p62控制通路的信号转导适配器功能，直接导致肿瘤发生。

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数字

图1
图1。代谢应激下自噬缺陷肿瘤细胞中p62持续升高
（A） p62的结构域组织说明Phox和Bem1p（PB1）寡聚化结构域（p62和非典型蛋白激酶C[aPKC]）、锌指（ZZ）Rip 1结合结构域、TRAF6结合位点（TBS）、微管相关蛋白轻链3（LC3/ATG8结合）结构域和泛素相关（UBA）（多-泛素结合）（B）在正常生长条件下（第0天），代谢应激7天（第7天），内源性p62的IF显示p62在自噬缺陷细胞中的积累和持续我)，和1（第7+1天R（右）)和2（第7+1天R（右）)恢复天数。（C） 自噬缺陷细胞表达较高水平的外源性Myc-p62。六个表达Bcl-2的独立细胞系第5天+/+和第5天−/−通过免疫印迹法和Myc标记抗体评估稳定表达Myc-tagged p62的iBMK细胞的p62表达水平。
图2
图2。代谢应激促进自噬缺陷细胞的细胞器损伤、ER伴侣和PDI上调
表达Bcl-2的代表性电子显微照片第5天+/+（A） 或第5天−/−（B） 代谢应激7天后的细胞。表达Bcl-2第5天+/+iBMK细胞（A）显示线粒体（M，蓝色箭头和C，左侧）、ER（E，红色箭头和C）、（B）中的突变细胞显示线粒体（M，蓝色箭头，D，左侧）和蛋白质聚集体（A，黄色和D，右侧）。（E和F）2-DIGE凝胶显示Bcl-2表达中ER伴侣（GRp170、GRp78）、PDI、PDI-P4Hβ和ACO2的差异调节第5天−/−iBMK细胞对代谢应激的反应（7天）。非应激或代谢应激（7天）表达Bcl-2的总蛋白第5天+/+和第5天−/−用Cy3（绿色未应激）或Cy5（红色应激）标记细胞系，并通过2-DIGE进行分析。图像显示2-DIGE凝胶含有在代谢应激下诱导（红色）、抑制（绿色）或不变（黄色）的蛋白质。选择差异表达的蛋白质点（n=106）并通过质谱鉴定。
图3
图3。自噬缺陷促进体内肿瘤内质网应激和DNA损伤反应增强
（A） 蛋白质印迹显示Bcl-2表达的p62、ER伴侣、PDI和泛素水平贝克林1+/+，贝克林1+/负极，第5天+/+和第5天−/−iBMK细胞经过5或7天的代谢应激，以及1和2天的恢复。低于条带的值表示与各组第一条通道中的基础蛋白水平相比的相对信号强度（未经处理的Bcl-2表达贝克林1+/+和第5天+/+控制）。（B–D）等位基因缺失贝克林1选择性地使细胞对内质网应激和蛋白酶体抑制敏感。MTT分析显示Bcl-2表达的敏感性贝克林1+/+（蓝色）和贝克林1+/负极（红色）iBMK细胞对（B）衣霉素（3天）、（C）环氧霉素（2天）和（D）浓度增加的代谢应激反应。数据表示为平均值±标准偏差。（E）自噬缺陷导致线粒体损伤。蛋白质印迹显示Bcl-2表达的线粒体蛋白（ACO2、LON、SOD2和PRDX3）水平贝克林1+/+，贝克林1+/负极，第5天+/+和第5天−/−代谢应激后的iBMK细胞。（F） 以下方面的不足第5天在iBMK细胞中促进肿瘤发生。移植瘤生长第5天+/+（红色），第5天+/负极（黄色）和第5天−/−裸鼠（蓝色）iBMK细胞系。（G） 以下方面的不足第5天与有缺陷的凋亡协同促进肿瘤生长。表达Bcl-2的肿瘤异体移植生长第5天+/+（红色），和第5天−/−裸鼠（蓝色）iBMK细胞系。（H） Western blot显示Bcl-2表达的p62和ER伴侣及PDI升高第5天+/+和第5天−/−iBMK肿瘤（I）肺和心脏组织中p62和GRp170水平升高贝克林1+/负极老鼠。两名1.5岁儿童的肺、心脏和自发性肺肿瘤切片贝克林1+/+和四个1.5岁的孩子贝克林1+/负极IHC对小鼠进行p62和GRp170染色。通过学生t检验（肺）或曼氏检验（心脏）对切片进行独立评分和分析，p<0.05具有统计学意义。（J） 肝组织中p62和GRp170升高，自发性肝肿瘤中p62、Mallory-Denk小体（H&E，箭头）和γ-H2AX（箭头）升高贝克林1+/负极小鼠（1.5岁）。通过学生t检验对截面进行独立评分和显著性分析（p<0.05）。（K） 人肝癌中p62、GRp170和γ-H2AX阳性细胞核升高。人类肝脏TMA的代表性图像（46个样本），显示HCC中H&E、p62、GRp170和γ-H2AX的积聚。显示了来自正常人类肝脏TMA（14个样本）的代表性图像以进行比较。对切片进行独立评分，并通过Students t检验对其显著性进行分析（p<0.05）。
图4
图4。代谢应激促进自噬缺陷细胞ROS生成增加和染色体不稳定性
（A） 自噬不足导致活性氧生成增加。覆盖显示Bcl-2表达的ROS水平贝克林1+/+（绿色）和贝克林1+/负极正常生长（0Di）和0.5、1、2.5和24小时时的iBMK细胞（蓝色）（x轴，对数刻度）(贝克林1+/+、绿色箭头和贝克林1+/负极，红色箭头）。未经处理的细胞中的ROS水平以虚线显示，以供比较。（B） 来自三个独立实验的代表性直方图，测量Bcl-2表达的平均活性氧水平贝克林1+/+和贝克林1+/负极iBMK细胞如（A）所示。（C） 清除活性氧可部分缓解代谢应激的易感性，并可因代谢应激的等位基因丢失而恢复贝克林1.表达Bcl-2的典型延时图像贝克林1+/+和贝克林1+/负极在活性氧清除剂NAC（1mM）存在（NAC）和不存在（UT）的情况下，经过5天的代谢应激恢复期的iBMK细胞（显示了与时间0相比粘附细胞的相对百分比）。（D） 清除活性氧抑制自噬缺陷患者p62的积累(贝克林1+/负极和第5天−/−)单元格。Bcl-2表达中p62水平的Western blot分析贝克林1+/+，贝克林1+/负极，第5天+/+和第5天−/−iBMK细胞系经过0或7天的代谢应激，然后在无NAC和有NAC的情况下恢复1天。（E） ROS清除限制了与等位基因缺失相关的非整倍体的进展贝克林1.表达Bcl-2的二倍体DNA含量的流式细胞术分析贝克林1+/+和贝克林1+/负极iBMK细胞在存在（蓝色）或不存在（红色）ROS清除剂NAC（1mM）的情况下生长。数字代表决定倍性的传代数。
图5
图5。不能通过自噬消除p62激活DNA损伤反应
（A） p62表达导致自噬缺陷的ROS生成增加贝克林1+/负极细胞。表达Bcl-2贝克林1+/+和贝克林1+/负极用myc标记的p62或对照载体转染iBMK细胞，转染后第3天通过流式细胞仪测定ROS水平（DCF-DA）。右边的柱状图代表了三个独立实验，测量转染后第1天和第3天每个细胞系中的平均ROS水平。（B） 代谢应激下自噬未能消除p62导致DNA损伤反应诱导。表达Bcl-2第5天+/+或第5天−/−稳定表达EGFP或p62-EGFP的iBMK细胞受到3天的代谢应激，使其恢复（1天）并进行γ-H2AX染色。（C） （B）所示细胞中γ-H2AX阳性病灶细胞百分比的定量。200个细胞的数据显示为p62 RNAi敲除的平均值±SD。（D）Western blots。表达Bcl-2的野生型(贝克林1+/+和第5天+/+)和自噬缺陷(贝克林1+/负极和第5天−/−)用Lamin-或p62-siRNA转染iBMK细胞，并承受代谢应激0、24、48或72小时（分别为转染后24、48、72和96小时），然后分析p62水平。（E） p62在自噬缺陷细胞中的积累负责DNA损伤反应的激活。评估（D）中的细胞的γ-H2AX阳性核灶。（F） 根据（E）中所示的数据定量γ-H2AX阳性细胞核的细胞百分比。200个单元格的数据表示为平均值±SD。
图6
图6。p62表达与自噬缺陷协同促进肿瘤生长
（A） 表达Bcl-2的EGFP的Western blot第5天+/+和第5天−/−iBMK细胞稳定表达EGFP或p62-EGFP。（B） （A）中细胞系的肿瘤生长显示p62-EGFP表达的肿瘤生长增强第5天−/−肿瘤（红色）与对照载体（黄色）相比。（C） 显示注射p62-EGFP-和表达EGFP的荷瘤小鼠的面板（右面板）第5天−/−注射后第74天取自（B）的iBMK细胞。（D） 表达p62-EGFP的肿瘤第5天−/−细胞与p62聚集体、多态性核和γ-H2AX阳性核相关。肿瘤冷冻切片（左）和石蜡包埋切片的代表性显微照片，用H&E（中）或IHC染色，检测γ-H2AX（右）[学生t检验显著性（p<0.05）]第5天−/−单元格如（C）所示。
图7
图7。p62在自噬缺陷细胞中的积累改变了参与宿主和抗氧化防御的信号转导途径
（A） 肿瘤中抑制的通路（p=0.05；黄线）第5天−/−通过IPA（蓝色条）和GSEA（紫色条）分析表达p62-EGFP的iBMK细胞与表达EGFP的细胞的比较。（B） Bcl-2野生型表达的荧光素酶报告物分析(贝克林1+/+)和自噬缺陷(贝克林1+/负极)iBMK细胞显示p62对自噬缺陷细胞中IL-6-荧光素酶报告子（NF-κB活性）的抑制。（C） Bcl-2表达的荧光素酶报告分析贝克林1+/+iBMK（WB3）细胞显示p62的过度表达足以以浓度依赖的方式抑制NF-κB转录活性。（D） 肝细胞存活受损、NF-κB活化和细胞因子产生贝克林1+/负极肝脏和贝克林1+/负极肝脏肿瘤。IHC染色显示肝组织和自发性肝肿瘤中凋亡细胞死亡（活性caspase-3）、NF-κB活化（核p50）和细胞因子产生（TNF-α）水平升高贝克林1−/−老鼠。（E） 自噬缺陷和p62积累抑制NF-κB活化并促进HCC。冷冻肝脏切片的代表性显微照片贝克林1+/+和贝克林1+/负极和自发性肝癌贝克林1+/负极小鼠，免疫染色p62（红色）和p65 NF-κB（绿色），并通过共焦显微镜进行分析。请注意贝克林1+/负极积聚p62的肝细胞不显示核p65（黄色箭头），而那些没有p62的则显示p65的核定位，表明NF-κB激活。（F） 通过限制p62的积累，自噬作为肿瘤抑制机制的作用模型。
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参考文献

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