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.2009年7月3日；325(5936):100-4.
doi:10.1126/science.1168974。 Epub 2009年6月11日。

LXR通过LDL受体的Idol-dependent泛素化调节胆固醇摄取

诺姆·泽尔切 1, 辛西娅·洪, 里玛·博亚杰, 彼得·托托尼奥斯
附属公司

LXR通过LDL受体的Idol-dependent泛素化调节胆固醇摄取

诺姆·泽瑟等。 科学类. .

摘要

细胞胆固醇水平反映了摄取、流出和内源性合成之间的平衡。在这里，我们发现固醇反应性核肝X受体（LXR）不仅通过促进胆固醇流出，而且通过抑制低密度脂蛋白（LDL）摄取，帮助维持胆固醇稳态。LXR通过转录诱导Idol（LDLR的诱导降解剂）抑制LDL受体（LDLR）途径，Idol是一种E3泛素连接酶，可触发LDLR在其细胞质域的泛素化，从而将其靶向降解。LXR配体以组织选择性的方式降低体内LDLR蛋白水平，而LXR敲除增加。肝细胞中的偶像击倒增加LDLR蛋白水平并促进LDL摄取。相反，腺病毒介导的Idol在小鼠肝脏中的表达可促进LDLR降解并升高血浆LDL水平。LXR-Idol-LDLR轴定义了一条到甾醇反应元件结合蛋白的互补途径，以调节胆固醇摄取。

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数字

图1
图1
LXR的激活通过降低LDLR蛋白表达抑制LDL摄取。（A） 二甲基亚砜或合成LXR配体GW3965（GW）和T090117（T）处理的HepG2细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中BODIPY-LDL的结合和摄取(N个= 6). （B） HepG2细胞用DMSO或GW（1μM）预处理8 h，然后在LPDS或含有DMSO和GW的甾醇消耗培养基（LPDS补充5μM辛伐他汀和100μM甲羟戊酸）中再培养18 h（C）将原代小鼠腹腔巨噬细胞培养在甾醇耗尽培养基中，并用指定剂量的GW处理8 h。（D）腹腔巨噬细胞培养于甾醇耗尽介质中，并使用GW（1μM）处理指定时间。（E） 。来自WT或Lxr公司αβ-/-小鼠在甾醇消耗培养基中培养，并用LXR配体处理。（F） 稳定表达LDLR-GFP的HepG2细胞经DMSO、GW或T（1μM）处理72小时后的免疫荧光图像。所有印迹均代表至少3个独立实验*P（P）<0.05，**P<0.01。本图和所有后续图中的误差条表示平均值±SD。
图2
图2
LXR靶基因Idol是LDLR蛋白水平的调节因子。（A） GW或T（1μM）治疗后小鼠原代肝细胞和腹腔巨噬细胞中Idol的LXR依赖性调节。（B） 40 mg/kg GW3956经口灌胃3天诱导小鼠组织中Idol mRNA表达(N个=每组6人）。实时PCR检测基因表达。（C） 与LDLR-GFP和野生型或RING域突变人类和小鼠Idol共同转染的HEK293细胞的免疫荧光图像。（D） 与mIdol和LDLR-GFP表达质粒联合转染的HEK293细胞中LDLR-GFP蛋白的剂量依赖性降低。用免疫印迹法分析总细胞裂解物。箭头表示偶像蛋白质。（E） 原代肝细胞、HepG2细胞或McRH7777细胞在甾醇耗尽培养基中培养，并用Ad-GFP或Ad-Idol感染。用免疫印迹法分析总细胞裂解物。（F） Ad-βgal或Ad-Idol感染后McRH777（McR）细胞和LXRαMEFs对BODIPY-LDL的摄取(N个= 3). 所有印迹均代表至少3个独立实验*P（P）< 0.05 **P（P）< 0.01.
图3
图3
偶像击倒诱导LDLR蛋白表达并促进LDL摄取。（A） 用对照组（shLamin）或两个独立的腺病毒Idol shRNA构建物感染LXRαMEF，并在甾醇缺乏培养基中培养。细胞裂解物通过免疫印迹分析。（B） 来自如在A中处理的McRH7777细胞的裂解物的免疫印迹分析。（C）通过实时PCR分析如在A中处理的LXRαMEFs中的基因表达(N个=3). （D） 在感染Ad-shLAMIN、Ad-shIdol2或Ad-shIdol4后，测定LXRαMEF的BODIPY-LDL结合和摄取(N个= 3). （E） 用Ad-shLAMIN或Ad-shIdol2感染McRH7777细胞，然后用二甲基亚砜或GW（1μM）治疗，测定其对BODIPY-LDL的摄取(N个= 4). （F） 用Ad-shLAMIN或Ad-shIdol2感染LXRαMEF 24 h。随后，用DMSO或GW处理细胞，然后在甾醇耗尽培养基中培养。所有印迹均代表至少3个独立实验***P（P）< 0.001.
图4
图4
Idol通过其细胞质域中保守残基的泛素化降低LDLR蛋白的表达。（A） Ad-LacZ或Ad-Idol HepG2-LDLR-GFP感染24小时后，用[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸15分钟，并按指示进行追踪。样品在标记后的指定时间点进行免疫沉淀。（B） 用LDLR-GFP、Idol和HA-ubiquitin表达质粒共转染HEK293细胞。36小时后，对裂解产物进行免疫沉淀和免疫印迹。（C） 与Idol和WT或突变的LDLR表达质粒共转染48 h后，通过免疫印迹分析HEK293细胞总裂解物。（D） 腹腔巨噬细胞在固醇耗尽培养基中培养，并用1μM GW3965处理4小时。用抗泛素免疫沉淀总裂解物，然后免疫印迹LDLR。（E） 用Ad-GFP或Ad-Idol感染原代小鼠肝细胞，并在甾醇耗竭培养基中培养。24小时后，用抗泛素抗体对裂解产物进行免疫沉淀，然后进行LDLR免疫印迹。（F） LDLR细胞内结构域的进化保护。指出了潜在的泛素化位点。（G） HEK293总细胞裂解物的免疫印迹分析，与对照或Idol表达质粒以及指示的突变LDLR构建物共同转染。LDLR构造中的编号是指1F。（H） 如图所示，用LDLR、突变LDLR（K6R/K20R/C29A）、Idol和HA-Ubiquitin表达质粒共同转染HEK293细胞。随后，用载体或25μM MG132处理细胞6 h。斑点是至少2个独立实验的代表。
图5
图5
偶像表达调节LDLR表达并影响血浆胆固醇和LDL水平体内（A）C57BL/6小鼠经口灌胃用40mpk GW3965处理3天。通过免疫印迹法分析常驻腹腔巨噬细胞、小肠（回肠）和肝脏的总裂解物的蛋白质水平。巨噬细胞是从腹膜腔中分离出来的，处理时没有在体外文化。（B） 用免疫印迹法分析WT和Lxrαβ-/-小鼠巨噬细胞、小肠（回肠）和肝脏的总裂解物。巨噬细胞是从腹膜腔中分离出来的，处理时没有在体外文化。（C） 用Ad-β-半乳糖或Ad-Idol转导C57BL/6小鼠6天后血浆胆固醇的分析。(N个=8只小鼠/组。）（D） 感染Ad-β-gal或Ad-Idol的小鼠的分级脂蛋白的胆固醇含量。（E） 肝总裂解物的免疫印迹分析。数据代表至少两个独立实验***第页< 0.001.
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