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.2009年4月；11(4):468-76.
doi:10.1038/ncb1854。 Epub 2009年3月8日。

与Beclin 1-磷脂酰肌醇-3-激酶复合物相关的Atg14L和Rubicon对自噬活性的不同调节

云忠, 王庆军, 李贤亭, 应艳, 乔纳森·M·巴克, 布莱恩·查特, 纳撒尼尔·海因茨, 岳振宇

与Beclin 1-磷脂酰肌醇-3-激酶复合物相关的Atg14L和Rubicon对自噬活性的不同调节

云忠等。 Nat细胞生物学. 2009年4月.

摘要

Beclin 1是一种哺乳动物自噬蛋白，与发育、肿瘤抑制、神经退行性变和细胞死亡有关，与Vps34（III类磷脂酰肌醇-3-激酶（PI（3）K）复合物存在，介导包括内吞和自噬在内的多个囊泡运输过程。然而，Beclin 1-Vps34复合物在自噬调节中的确切作用仍有待阐明。结合小鼠遗传学和生物化学，我们鉴定出一个含有已知蛋白Vps34、p150/Vps15和UVRAG的体内大Beclin 1复合物，以及两个新鉴定的蛋白，Atg14L（酵母Atg14-like）和Rubicon（RUN域和富含半胱氨酸的域，Beclin 1-相互作用蛋白）。对新蛋白的表征表明，Atg14L增强了Vps34脂激酶活性并上调了自噬，而潞碧垦降低了Vps34-活性并下调了自吞噬。我们表明，Beclin 1和Atg14L协同促进与Atg5和Atg12相关的双膜细胞器的形成，而Rubicon的强制表达导致异常的晚期内胚体/溶酶体结构和受损的自噬体成熟。我们假设，通过形成不同的蛋白复合物，Beclin 1及其结合蛋白在多个步骤中协调III类PI（3）K在调节自噬中的精确功能。

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数字

图1
图1。新型Beclin 1相互作用蛋白的鉴定贝克1−/−;Becn1-EGFP公司/+小鼠
（a） Western blot分析显示，Beclin 1-EGFP替代了内源性Beclin 1贝肯1−/−;Becn1-EGFP公司/+抗Beclin 1抗体检测到的小鼠。（b） 考马斯染色SDS-PAGE显示，Beclin 1相互作用蛋白免疫分离自“获救”小鼠（第2和第4通道）和对照小鼠的脑和肝组织贝肯1+/−使用抗GFP抗体的室友（1道和3道）。提取凝胶带中的蛋白质并通过质谱鉴定为Vps15/p150（带1）、Vps34/III类PI-3K（带3）、UVRAG（带4）、Beclin 1-EGFP（带5）和两种新蛋白质Atg14L（带6，星号，gi | 27369860）和Rubicon（带2，星号、gi | 45708948）。值得注意的是，UVRAG水平随亲和纯化条件的不同而变化，这表明UVRAG与复合物的结合相对不稳定。（c） Atg14L和潞碧垦的域结构示意图。Atg14L包含两个线圈结构域（CCD1和CCD2），它们也与SMC结构域（染色体结构维持）同源。潞碧垦包含N端RUN（用于R（右）PIP8、，U型NC-14和N个ESCA）结构域、C末端富含半胱氨酸的结构域和中央CCD结构域。（d） 对野生型小鼠肝提取物凝胶过滤组分中的Atg14L、Rubicon、Vps34和Beclin 1进行的Western blot分析表明，这些蛋白质在组分38–45中共同洗脱。Atg14L也在随后的51-56馏分中洗脱。甲状腺球蛋白（670 kDa）和γ球蛋白（158 kDa。将对照siRNA-转染的NIH 3T3细胞裂解物作为阳性对照（标记为“1”），用于Atg14L蛋白在SDS-PAGE上的迁移位置；将Atg14L siRNA-转染的NIH 3TC细胞裂解物作为阴性对照（标记为“2”）。（e-f）共免疫沉淀证实了Atg14L和Rubicon之间的蛋白质-蛋白质相互作用。用Atg14L-EGFP和FLAG-Rubicon（e）或Rubicon-EGFP和FLAG-Atg14L（f）联合转染HEK 293细胞。用细胞裂解液与抗GFP抗体进行免疫沉淀，并用抗FLAG抗体对所得免疫沉淀进行印迹。我们的结果显示，Atg14L（e）可以免疫沉淀潞碧垦，反之亦然（f）。WCL：全细胞裂解液；IP：免疫沉淀。
图2
图2。Atg14L正向调节自噬；Beclin 1和Atg14L协同促进双膜形成
（a） 在NIH 3T3细胞中，Beclin 1或Atg14L siRNA在正常和营养缺乏条件下均降低了Atg14L水平，增加了p62/SQSTM1和LC3 II水平。（b） 与对照siRNA相比，Atg14L siRNA降低了NIH 3T3细胞在两种正常情况下的长期蛋白降解(对=0.007）和饥饿(对=5E-6）条件（星号，方差相等的单尾Student t检验，n=4）。当饥饿细胞用PI-3K抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）处理时，这种差异减小。（c） Vps34激酶测定。在没有或存在Beclin 1-EGFP的情况下，用myc-Vps34-Vps15和FLAG-Atg14L或FLAG载体共同转染HEK 293T细胞。Myc-Vps34-Vps15通过抗Myc抗体免疫沉淀，用于在体外激酶分析。所得放射性PtdIns（3）P通过薄层色谱法（TLC）分离（左下方），根据免疫沉淀myc标记的Vps34的量进行量化和标准化，如Western blot所测（左上方）。定量结果（右侧面板）表明，过表达Atg14L显著上调Vps34激酶活性2.5倍，但仅当Beclin 1也过表达时（星号，对=0.04，方差不等的单尾Student t检验，n=5）。（d） 瞬时转染HeLa细胞点状结构中共同表达的Atg14L-EGFP（绿色）和Beclin 1-AsRed（红色）的共扩增。比例尺：10μm。（e） 电子显微镜图像显示，与Atg14L-EGFP和Beclin 1-AsRed共转染的HEK 293T细胞中的大结构（蓝色星号）通常包裹着双层膜：（e1）同心膜“环”；（e2）两个大结构（直径3-5μm）包含高电子密度材料；嵌入，包裹双层膜；（e3）细胞质中有大量自噬体（蓝色箭头）；（e4）用同心膜“环”包裹的Atg14L-Beclin 1结构（用抗GFP抗体标记并由DAB显影）的免疫电镜图像。缩写：M–线粒体，N–细胞核。比例尺：500 nm。（f-g）EGFP-Atg12（f）或EGFP-Agg5（g）（绿色）与转染HeLa细胞中Atg14L-AsRed（红色）和Beclin 1-myc（蓝色）标记的大结构（箭头）共定位。其中一些结构似乎是“环形”形状（黄色箭头和插图）。比例尺：10μm。
图2
图2。Atg14L正向调节自噬；Beclin 1和Atg14L协同促进双膜形成
（a） 在NIH 3T3细胞中，Beclin 1或Atg14L siRNA在正常和营养缺乏条件下均降低了Atg14L水平，增加了p62/SQSTM1和LC3 II水平。（b） 与对照siRNA相比，Atg14L siRNA降低了NIH 3T3细胞在两种正常情况下的长期蛋白降解(对=0.007）和饥饿(对=5E-6）条件（星号，单尾学生t检验，方差相等，n=4）。当饥饿细胞用PI-3K抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）处理时，这种差异减小。（c） Vps34激酶测定。在不存在或存在Beclin-1-EGFP的情况下，用myc-Vps34-Vps15和FLAG-Atg14L或FLAG载体共转染HEK 293T细胞。Myc-Vps34-Vps15通过抗Myc抗体免疫沉淀，用于在体外激酶分析。所得放射性PtdIns（3）P通过薄层色谱法（TLC）分离（左下方），根据免疫沉淀myc标记的Vps34的量进行量化和标准化，如Western blot所测（左上方）。定量结果（右侧面板）表明，过表达Atg14L显著上调Vps34激酶活性2.5倍，但仅当Beclin 1也过表达时（星号，对=0.04，方差不等的单尾Student t检验，n=5）。（d） 在瞬时转染的HeLa细胞中，共表达的Atg14L-EGFP（绿色）和Beclin-1-AsRed（红色）在点状结构中的共定位。比例尺：10μm。（e） 电子显微镜图像显示，与Atg14L-EGFP和Beclin 1-AsRed共转染的HEK 293T细胞中的大结构（蓝色星号）通常包裹着双层膜：（e1）同心膜“环”；（e2）两个大结构（直径3-5μm）包含高电子密度材料；嵌入，包裹双层膜；（e3）细胞质中有大量自噬体（蓝色箭头）；（e4）用同心膜“环”包裹的Atg14L-Beclin 1结构（用抗GFP抗体标记并由DAB显影）的免疫电镜图像。缩写：M–线粒体，N–细胞核。比例尺：500 nm。（f-g）EGFP-Atg12（f）或EGFP-Agg5（g）（绿色）与转染HeLa细胞中Atg14L-AsRed（红色）和Beclin 1-myc（蓝色）标记的大结构（箭头）共定位。其中一些结构似乎是“环形”形状（黄色箭头和插图）。比例尺：10μm。
图3
图3。潞碧垦是自噬的负调控因子
（a） 在正常和营养缺乏条件下，对NIH 3T3细胞进行Rubicon siRNA处理导致p62和LC3 II水平降低。（b） Rubicon的过度表达导致HEK 293细胞在正常和营养目标条件下p62水平升高，无论是稳定表达（上面板）还是瞬时转染（下面板）Rubicon-EGFP。对照细胞稳定表达或瞬时转染EGFP-N3载体。（c） Vps34激酶活性。在没有或存在Beclin 1-EGFP的情况下，用myc-Vps34-Vps15和FLAG-Rubicon或FLAG载体共同转染HEK 293T细胞。Myc-Vps34-Vps15通过抗Myc抗体免疫沉淀，用于在体外激酶分析。通过TLC分离产生的放射性PtdIns（3）P，并根据免疫沉淀myc标记的Vps34的量进行量化和归一化，如Western blot所测（左上图）。量化结果（右图）显示过表达Rubicon显著下调Vps34激酶活性至0.58倍，但仅当没有Beclin 1过表达时（星号，对=0.04，使用方差不等的单尾Student t检验，n=4）。（d） 通过mCherry-GFP-LC3荧光监测过表达FLAG-Rubicon对自噬体酸化的影响。用mCherry-GFP-LC3和FLAG-Rubicon（或对照FLAG载体）瞬时联合转染HeLa细胞。共表达mCherry-GFP-LC3和对照FLAG载体的细胞含有许多红色点状物和黄色点状物（表明存在红色和绿色点状物），这表明存在自溶体和新生自噬体（上图）。相反，共表达mCherry-GFP-LC3和FLAG-Rubicon的细胞主要含有黄色斑点，表明只有新生的自噬体（下表，白色箭头）。值得注意的是，一些与mCherry-GFP-LC3和FLAG-Rubicon联合转染但表达高水平mCherry-GFP-LC3和检测不到的FLAG-Rubinoc的细胞含有许多红色斑点（低面板，黄色箭头）。（e） 对（d）中结果的定量分析表明，过表达FLAG-Rubicon显著降低了红点（mCherry-LC3）的百分比，从对照FLAG载体转染的对照细胞中的39%降至FLAG-Rubincon转染细胞中的2%（星号、，对=2E-26，方差不等的单尾Student t检验，n=30），表明Rubicon的过度表达阻碍了自噬体酸化或成熟。
图4
图4。Rubicon过度表达导致晚期内体/溶酶体异常膨胀
（a） 在转染Rubicon-EGFP的HeLa细胞中，Rubicon-GGFP相关结构（绿色）与晚期内体/溶酶体标记Lamp1（红色）（箭头）的共扩增。注意，一些Rubicon-EGFP相关结构显示为“环形”（黄色箭头）。比例尺：10μm。（b） 在转染Rubicon-EGFP的HeLa细胞中，Rubicon-GGFP相关结构（绿色）与MVB标记物LBPA（红色）（箭头）的部分共定位。比例尺：10μm。（c） 典型的超微结构图像显示过度表达Rubicon-EGFP的HEK 293T细胞中晚期内体/溶酶体结构异常扩张。这些异常细胞器体积大，电子密度高（橙色箭头）或低（黑色箭头）。一些包含小泡（紫色箭头），一些类似MVB（蓝色箭头）。比例尺：500 nm。（d） 典型的超微结构图像显示了瞬时转染Rubicon-EGFP的HEK 293T细胞中被抗GFP金颗粒（图3–4）标记的晚期内体/溶酶体样结构。这些结构由双层膜包裹（面板4插图），并由抗GFP（由DAB开发）和抗Lamp1（金增强）（面板5-7）共同标记。请注意，线粒体对Rubicon-EGFP大多呈阴性（图4）。阴性对照组无抗体（第1-2组）。M–线粒体。比例尺：200纳米。
图5
图5。过表达的Rubicon以Beclin 1独立的方式定位在PtdIns（3）P富集结构上
（a） 潞碧垦的C末端富含半胱氨酸的结构域与几个已知的FYVE蛋白的FYV结构域之间的局部序列比对。潞碧垦不具备典型FYVE域的关键一致序列，即N端WxxD、中心R[R/K]HHCR和C端RVC（用红色条表示）。（b） 在共转染HeLa细胞（上部面板）的大点状结构（箭头）上，PtdIns（3）富含磷的脂质域标记物p40（phox）-PX-EGFP（绿色）和Rubicon-AsRed（红色）的共定标。在用75 nM沃特曼（另一种PI-3K抑制剂）短时间治疗1 h后，当富含PtdIns（3）P的脂质结构域消失时，Rubicon-AsRed阳性结构保持不变（下表）。比例尺：10μm。（c） HeLa细胞中瞬时转染Rubicon-EGFP、Rubicon（ΔRUN）-EGFP，Rubicon-（Δc）-EGFP-或Rubicon/（ΔRUNΔc”-EGFP的亚细胞定位。与点状Rubicon-EGFP和Rubicon（ΔRUN）-EGFP相比，Rubicon-（ΔC）-EGFP和Rubioc-（Δ）RUNΔC，-EGFP分散在细胞质中。缩写：ΔRUN–RUN域删除，ΔC–富含半胱氨酸的域删除。比例尺：10μm。（d-e）在稳定表达Rubicon-EGFP的HEK 293细胞中，Rubicon-GGFP阳性结构（绿色）上没有全长Beclin 1（d）或Beclin 1-CE突变体（e）（红色）。用（d）Beclin 1-AsRed或（e）FLAG-Beclin 1-CE瞬时转染这些细胞（即含有CCD和ECD的FLAG-tagged Beclin 1突变体，其介导Beclin-1-Rubicon相互作用，如图S3h所示）。比例尺，10μm。（f） 在稳定表达Rubicon-EGFP的HEK 293细胞中，Beclin 1的siRNA敲除不影响Rubicon-GGFP阳性结构的形成。（g） Beclin 1-Vps34蛋白复合物及其功能的假设模型。在该模型中，核心Beclin 1复合体由Vps34/PI-3K、p150/Vps15、Beclin l、UVRAG和可能的亚化学计量Atg14L组成（由Atg14L和Beclin I之间的紧密结合和功能连接表示）。在生理条件下，形成一个大的Beclin 1-Vps34复合物，包括核心复合物和Rubicon。这种大的络合物可以被还原成较小的络合物，例如含Atg14L-Beclin 1的络合物和含Rubicon的络合物。这些较小的复合物可能是通过调节Vps34脂质激酶活性参与自噬调节的功能单元。
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