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。2009年4月；20(7):2004-14.
doi:10.1091/mbc.e08-12-1250。 Epub 2009年2月18日。

在TOR介导的自噬调节中具有多重作用的Atg1/Atg13复合物

张玉云 1, 托马斯·普·纽费尔德
附属公司

在TOR介导的自噬调节中具有多重作用的Atg1/Atg13复合物

张玉云等。 分子生物学细胞。 2009年4月。

摘要

TOR激酶是对营养条件作出反应的自噬的保守负调控因子，但其信号机制尚不清楚。在这里，我们描述了一种包含蛋白激酶Atg1和磷酸蛋白Atg13的复合物，它们是果蝇这种调节的关键成分。我们发现，敲除Atg1或Atg13会导致TOR失活引起类似的选择性自噬缺陷。Atg1在体内与TOR和Atg13发生物理性相互作用，并且Atg1和Attg13均以营养素、TOR和Atg1激酶依赖的方式磷酸化。与酵母相反，Atg13的磷酸化在自噬条件下最大，并且不排除Atg1-Atg13的结合。Atg13刺激Atg1的自噬活性及其对细胞生长和TOR信号的抑制，部分是通过干扰TOR的正常运输。与正常Atg13水平的影响相反，Atg13的表达增加可能通过降低Atg1的稳定性并通过TOR促进其抑制性磷酸化来抑制自噬体扩张和Atg8/LC3的募集。因此，Atg1-Atg13复合物在多个水平上发挥作用，调节营养依赖性自噬信号。

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数字

图1。
图1。
基因突变的产生果蝇Atg13（A）酵母、人类（KIAA0652）和苍蝇（CG7331）Atg13同源序列C末端区域的氨基酸序列比对。将相同的残留物装箱。星号表示Δ81缺失的程度。（B） 显示Δ74和Δ81删除相对于附件13转录本和P元素GS11822。虚线表示用于产生反向重复RNAi构建体7331-R1的序列。（C） 幼虫纯合或杂合的基因组DNA附件13使用B中箭头所示的引物，通过PCR分析Δ74和Δ81缺失。从野生型和杂合样品中扩增出1720碱基对片段。携带Δ74等位基因的动物产生的产物较小（1474个碱基对），而携带Δ81等位基因者产生的产物为3.3kb，反映了切除的P元件的2.2kb残基和基因组DNA的593碱基对缺失，如序列分析所示。
图2。
图2。
TOR下游的饥饿诱导自噬需要Atg13。（A）附件13突变细胞在4-h饥饿诱导的自噬中有缺陷。图中显示的是由克隆的附件13−/−细胞（GFP阴性）和杂合对照细胞（GFP-阳性）；所有细胞都表达mCherry-Atg8a，作为自噬小泡（自噬体和自溶体）的标记，在对照细胞中表现为点状结构。（B） 在以下克隆中，因饥饿4小时而产生酸化的自溶体是有缺陷的附件13突变细胞（GFP阴性），如缺乏LysoTracker红染色所示。（C）附件13−/−细胞（mCherry-阴性）积累高水平的转基因GFP-Ref（2）P.（D）第13页突变细胞（GFP-阴性）在雷帕霉素治疗24小时后未能诱导mCherry-Atg8a标记的小泡。（E） 损失附件13不会干扰对Jnk信号激活的自噬诱导。Jun-kinase同源物Bsk（GFP-阳性细胞）的表达导致Atg13突变动物（如图所示）和野生型对照动物（未公布的数据）中出现高水平的点状LysoTracker染色。A中的比例尺表示A、C和D中的10μm，B和E中的25μm。基因型：（A和D）hsFLP；Cg-GAL4/+; UAS-mChAtg8a FRT82B UAS-GFPnls/FRT82B Atg13Δ74; （B）hsFLP；Cg-GAL4/+; FRT82B UAS-GFPnls/FRT82B附件13Δ81; （C）hsFLP；Cg-GAL4/UAS-GFP-参考（2）P；FRT82B UAS-mCherry/FRT82B Atg13Δ81; 和（E）hsFLP；法案>年+>GAL4无人机GFPnls/+; UAS-bsk附件13Δ81/附件13Δ81。
图3。
图3。
Atg1和Atg13的共表达增加了它们的营养素依赖性磷酸化。所示为脂肪体组织的免疫印迹分析果蝇属使用hs-GAL4驱动程序表达所示转基因的幼虫。（A） Atg13的表达增加了Myc-Atg1的磷酸化，尤其是在喂食条件下。喂食或饥饿条件下Myc-Atg1的较慢形式通过小牛肠磷酸酶（CIP）治疗消除。（B） 在喂食条件下，激酶缺陷型Myc-Atg1的磷酸化与野生型Myc-Atg1相比较少。Tsc1和Tsc2的共表达进一步降低Myc-Atg1杜兰特磷酸化。表达Myc-Atg1的样本杜兰特（5-8车道）稀释五倍，以平衡Myc-Atg1水平重量和Myc-Atg1KD（分子量）表达。（C） Rheb的共表达增加了饥饿条件下Myc-Atg1的磷酸化水平，而Tsc1/Tsc2降低了喂食条件下Myc-Atg1磷酸化水平。（D） Myc-Atg1共表达显著降低了饥饿条件下Atg13-Flag的迁移率，因为CIP处理显示磷酸化增加。（E） 激酶缺陷型Myc-Atg1的共表达不会导致Atg13-Flag磷酸化增加。（F） Rheb的共表达增加了喂食条件下Atg13-Flag的磷酸化。过度表达Tsc1/Tsc2对Atg13-Flag磷酸化几乎没有影响。（G） 在激酶缺陷型Myc-Atg1表达和Tsc1/Tsc2过度表达导致TOR信号中断时，无法检测到Atg13-Flag的磷酸化。
图4。
图4。
Atg1和Atg13之间的生化和遗传相互作用。（A） Atg1和Atg13在喂食和饥饿条件下都会发生关联。使用hs-GAL4驱动程序表达Atg13-Flag±Myc-Atg1的幼虫的脂肪体提取物用抗Myc珠免疫沉淀。高磷酸化和低磷酸化形式的Atg13都与Myc-Atg1共沉淀，饥饿增加了相互作用。Atg13还与激酶缺陷型Myc-Atg1共沉淀，后者的表达水平远远高于野生型Myc-Atg1。（B–D）Atg13刺激Myc-Atg1的自噬活性。表达mCherry-Atg8a的脂肪体组织的代表性图像显示，在热休克1小时后24小时，转基因对hs-GAL4的反应。在喂食条件下，mCherry-Atg8a在对照（B）中扩散，并在表达Myc-Atg1的细胞中形成小的核周自噬体（C）。Myc-Atg1和Atg13的低水平共表达（D）导致自噬体形成的强烈诱导。（E–G）Myc-Atg1和Atg13协同抑制细胞生长。GFP标记的脂肪体细胞克隆中Myc-Atg1（E）或Atg13（F）的表达对细胞大小没有明显影响。与相邻对照（GFP-阴性）细胞（G）相比，共表达Myc-Atg1和Atg13的细胞尺寸显著减小。Alexa Fluor 555卵磷脂染色以红色突出细胞边界。（H–K）使用GMR-GAL4驱动程序在发育中的眼睛中表达Myc-Atg1或Atg13对眼睛发育（I和J）没有明显影响，而共表达导致共同模式（K）的破坏。（五十） 使用Cg-GAL4驱动程序在整个幼虫脂肪体中组成性表达Myc-Atg1或Atg13不会影响幼虫的生长或发育时间。这些转基因的共表达导致生长发育停滞在发育的第一阶段。（M） 在喂食条件下，Atg1过度表达诱导自噬需要Atg13。Cg-GAL4驱动的Myc-Atg1表达诱导了mCherry-Atg8a在GFP阳性对照细胞中的点状定位，但在GFP突变细胞克隆中没有诱导附件13以缺乏GFP为标志。B中的比例尺表示B–G和m中的10μm，H–K中的100μm，L中的700μm。基因型：（B）hs-GAL4 UAS-m樱桃-Atg8a/+; （C）hs-GAL4 UAS-mCherry-Atg8a/UAS-Myc-Atg1; （D）UAS附件13/+; hs-GAL4 UAS-mCherry-Atg8a/UAS-Myc-Atg1; （E）hsFLP；法案>CD2（CD2）>GAL4 UAS-GFP/UAS-Myc-Atg1; （F）hsFLP；UAS附件13/+; 法案>CD2（CD2）>GAL4无人机-GFP/+; （G）hsFLP；UAS附件13/+; 法案>CD2（CD2）>GAL4 UAS-GFP/UAS-Myc-Atg1; （H）GMR-GAL4公司/+; （一）GMR-GAL4公司/+; UAS-Myc-Atg1型/+; （J）GMR-GAL4/UAS-Atg13基因; （K）GMR-GAL4/UAS-Atg13；UAS-Myc-Atg1型/+; （五十） 从左到右：Cg-GAL4/+，Cg-GAL4/+; UAS-Myc-Atg1型/+，Cg-GAL4/UAS-Atg13，Cg-GAL4/UAS-Atg13；UAS-Myc-Atg1型/+; 和（M）hsFLP/UAS-Myc-Atg1；Cg-GAL4/+; UAS-mCherry-Atg8a FRT82B UAS-GFPnls/FRT82B Atg13Δ74。
图5。
图5。
Atg13过度表达抑制自噬。除非另有说明，否则所有面板均显示饥饿4小时动物的脂肪体组织。（A和B）饥饿诱导对照组（A）中mCherry-Atg8a阳性自噬体的诱导，但在过度表达Atg13（B）的动物中没有诱导。（C） Atg13-GFP细胞的克隆表达会自动干扰LysoTracker红色标记自溶体的积累。（D和E）Atg13-GFP的分布从喂食条件下的扩散模式（D）变化为饥饿4小时后的小而均匀的点状结构（E）。Atg13-GFP点状物（E中的框状区域，E′中的放大）小于mCherry-Atg8a标记的自噬体和自溶体（A中的框形区域，A′中的扩大）。（F） 在高水平Atg13-GFP表达的细胞中，大多数Atg13-GFP阳性结构不能用mCherry-Atg8a标记。黄色圆圈表示同位化示例。（G） Atg13-GFP在低水平Myc-Atg1和Atg13-GFP共表达的细胞中定位于mCherry-Atg8a标记的自噬体。黄色圆圈表示同位化示例。（H） 损失附件13导致Myc-Atg1水平升高。双细胞克隆附件13突变细胞（以缺乏GFP为标志）含有比相邻对照细胞更高水平的Myc-Atg1（红色）。（I和J）饥饿诱导的Atg13-GFP再分配被Rheb（I）的共表达阻断，但与附件1（J） ●●●●。Atg13-GFP定位于对照细胞和细胞克隆中的点状结构中附件1（J中的中央细胞）。除A′和E′5μm、C 38μm和H 20μm外，所有面板中的标尺A代表10μm。基因型：（A）hsFLP（高速飞行计划）/+; 法案>CD2（CD2）>GAL4 UAS-m樱桃-Atg8a/+; （B–E）hsFLP（高速飞行计划）/+; UAS附件13-GFP/+; 法案>CD2（CD2）>GAL4 UAS-m樱桃-Atg8a/+; （F）无人机-Atg13-GFP/+; hsGAL4 UAS-m樱桃-Atg8a/+; （G）UAS附件13-GFP/+; hsGAL4 UAS-mCherry-Atg8a/UAS-Myc-Atg1; （H）hsFLP/UAS-Myc-Atg1；Cg-GAL4/+; UAS-mCherry-Atg8a FRT82B UAS-GFPnls/FRT82B Atg13Δ74; （一）hsFLP（高速飞行计划）/+; UAS附件13-GFP/+; 法案>CD2（CD2）>GAL4 UAS-GFPnls UAS-RhebAV4型; 和（J）hsFLP（高速飞行计划）/+; UAS-Atg13-GFP/Cg-GAL4；FRT82B UAS-myrRFP/附件1Δ三维 FRT80B型。
图6。
图6。
Atg1/Atg13和TOR之间的相互抑制作用。（A和B）Myc-Atg1和Atg13抑制TOR活性。对表达Myc-Atg1和/或Atg13和hs-GAL4的三龄晚期动物的脂肪体提取物进行内源性dS6K磷酸化检测。（A） dS6K Thr398的磷酸化受到Myc-Atg1表达的适度抑制，不受Atg13表达的影响，并且受到Myc-Atg1和Atg13共表达的强烈抑制。内源性d4EBP水平受TOR信号转录抑制，随着Myc-Atg1和Atg13的表达而升高到可检测水平（A）。（B） Atg1过度表达抑制了过度表达d4EBP的Thr37/46的磷酸化。（C–E）Myc-Atg1和Atg13干扰TOR贩运。hs-GAL4-driven Flag-TOR在诱导24小时后定位于对照脂肪体细胞的核周隔室（C）。低水平Myc-Atg1和Atg13的共同表达导致Flag-TOR在点状/囊泡结构中积聚（D）。组成表达的Flag-TOR（E）定位于对照细胞中的小泡和点状结构的表面（E′中GFP阳性）。这些结构和Flag-TOR的总体水平在以下突变细胞的克隆中降低：第13页（E′中GFP阴性细胞）。（F和G）TOR活性抑制Myc-Atg1的积累。使用Cg-GAL4在所有脂肪体细胞中均匀表达Myc-Atg1，在克隆的Tsc1型突变细胞（F）和Rheb公司将突变细胞（G）与相邻对照细胞（F′和G′中的GFP阳性细胞）进行比较。损失Tsc1型减少和损失Rheb公司增加Myc-Atg1水平。比例尺，（C–G）10μm。（H） 喂食和饥饿动物的Atg1和TOR共免疫沉淀。单独表达hs-GAL4-driven Flag-TOR或同时表达Flag-TOR和Myc-Atg1的幼虫的脂肪体提取物用抗-Myc珠免疫沉淀。（一） Hs-GAL4驱动的Flag-TOR共表达刺激Myc-Atg1的磷酸化。基因型：（C）高速飞行计划/+; UAS标志-dTOR四层甲/+; 法案>CD2（CD2）>镀锌4; （D）hsFLP（高速飞行计划）/+; UAS-FlagTOR系统四层甲/UAS-Atg13；法案>CD2（CD2）>GAL4/UAS-Myc-Atg1; （E）hsFLP（高速飞行计划）/+; UAS-FlagTOR系统四层甲/+; r4-GAL4 FRT82B UAS-GFPnls/FRT82B附件13Δ81; （F）hsFLP/UAS-MycAtg1；Cg-GAL4/+; FRT82B无人机GFPnl/FRT82B Tsc129; （G）hsFLP/UAS-MycAtg1；Cg-GAL4/+; FRT82B UAS-GFPnls/FRT82B Rheb公司二维图1。
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