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.2009;4（1）：e4235。
doi:10.1371/journal.pone.0004235。 Epub 2009年1月21日。

神经母细胞瘤细胞系含有对靶向溶瘤病毒敏感的多潜能肿瘤起始细胞

约纳坦·Y·马勒 1, 乔恩·威廉姆斯, 威廉·贝尔德, 布莱恩·米顿, 乔纳森·格罗斯海姆, Yoshinaga Saeki先生, 何塞·A·坎塞拉斯, 南希·拉特纳, 蒂莫西·P·克里普
附属公司

神经母细胞瘤细胞系含有对靶向溶瘤病毒敏感的多潜能肿瘤起始细胞

约纳坦·Y·马勒等人。 公共科学图书馆一号. 2009.

摘要

背景：尽管神经母细胞瘤患者通常可以获得疾病缓解，但复发是常见的。癌症干细胞理论表明，罕见的致瘤细胞对常规治疗有抵抗力，是导致复发的原因。如果对神经母细胞瘤来说是真的，那么只有通过识别和靶向治疗神经母细胞肿瘤起始细胞才能提高治愈率。根据正常干细胞的线索，在多种癌症中发现了肿瘤祖细胞的证据。

方法/主要发现：八种人类神经母细胞瘤细胞系中有四种在神经干细胞培养基中形成肿瘤球，所有细胞都含有一些表达神经源性干细胞标记物的细胞，包括CD133、ABCG2和nestin。所测试的三个品系可以诱导成多系分化。进一步研究了LA-N-5微球，发现维拉帕米对白细胞介素敏感的侧群，对阿霉素的相对耐药性，CD133+细胞显示球状形成和致瘤性增加。通过基因突变使溶瘤病毒在临床上具有安全性，正成为新一代抗癌药物。由于溶瘤病毒绕过了典型的耐药机制，它们可能是对化疗耐药肿瘤起始细胞的有效治疗。Nestin靶向的溶瘤单纯疱疹病毒在神经母细胞瘤肿瘤起始细胞内有效复制并杀死，阻止其在无胸腺裸鼠中形成肿瘤。

结论/意义：这些结果表明，人类神经母细胞瘤含有肿瘤起始细胞，可被溶瘤病毒有效靶向。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。神经母细胞瘤细胞在无血清培养基中形成肿瘤球。
（A） 在补充血清的培养基中培养的LA-N-5神经母细胞瘤细胞呈贴壁生长，而在无血清培养基（含EGF和bFGF）中培养的细胞则形成非贴壁肿瘤球。（B） 分离的大块细胞和瘤球细胞接受FACS分析。与大量培养细胞相比，瘤球细胞在复杂性上表现出更高的一致性（低侧面散射）。（C） 仅在神经球介质中连续传代（以超克隆密度电镀）形成肿瘤球，或补充γ-分泌酶抑制剂（L685458，1 mM）或EGFR抑制剂（厄洛替尼，10µM）。抑制剂溶解在DMSO中，DMSO用作阴性对照。（D） 将分离的LA-N-5肿瘤球细胞以每孔100或10个细胞的速度电镀，无论电镀密度如何，均显示出一致的成球效率；30%镀有单个电池的孔含有单个球体。图片显示了克隆衍生球体的示例。
图2
图2。神经母细胞瘤瘤球的超微结构特征与正常神经球相似。
（A） 神经母细胞瘤瘤球的扫描电镜显示表面光滑均匀。（B） 通过透射EM在横截面上显示肿瘤球表面的微绒毛状结构。（C） 透射电镜显示肿瘤细胞在瘤球核心紧密堆积。（D） 凋亡的瘤球细胞出现核泡、染色质断裂和线粒体肿胀。
图3
图3。克隆来源的神经母细胞瘤瘤细胞表现出多谱系分化。
分离来自三种不同神经母细胞瘤细胞系的克隆衍生的肿瘤球，并将细胞接种在聚赖氨酸和层粘连蛋白涂层的室载玻片上。培养条件为仅含血清或含神经营养因子（顶行）、胶质生成因子（中行）或成纤维细胞因子（底行）的血清的培养基（阴性对照除外，阴性对照为无因子的单独血清）。玻片用神经丝-M（NF-M，绿色，顶行）、GFAP（红色，中行）、S100β（绿色，中排）或平滑肌肌动蛋白（红色，底行）染色；每一个也用DAPI（蓝色）共同染色。阴性对照培养物在不含一级抗体的情况下与二级抗鼠TRITC或抗兔FITC孵育。顶行和底行中的箭头表示与神经元或成纤维细胞分化一致的纺锤体样细胞延伸，而中间行中的箭表示阳性染色细胞。在仔细检查GFAP/S100β染色时，血清条件下的IMR-32细胞和添加因子的CHP-134细胞显示出绿色/红色混合信号的共同染色。比例尺=65微米。
图4
图4。神经母细胞瘤瘤球衍生细胞对阿霉素耐药，并表达ABCG2和CD133。
（A） 在第7天通过MTT测定评估LA-N-5体细胞和肿瘤球来源的细胞对阿霉素的敏感性。（B） 作为体培养物或肿瘤球生长的神经母细胞瘤细胞中ABCG2和CD133表达的分析。
图5
图5。侧面群体分析揭示了神经母细胞瘤细胞的不对称细胞分裂。
（A） 使用Hoechst 33342，+/-维拉帕米对在阿霉素（LAN5-dox）中生长的LA-N-5细胞（LAN5）和LA-N-5散装细胞进行侧面群体分析R（右）). （B） LAN5和LAN5-dox中ABCG2和CD133的表达分析R（右）细胞。（C） 来自LAN5和LAN5-dox的分选SP和非SP（NSP）细胞的成球效率R（右）文化。（D） 从LAN5和LAN5-dox培养物中分选SP和NSP细胞R（右），在含有血清的培养基中放置2周，并由副作用人群+/-维拉帕米重新评估。SP衍生培养物显示SP和NSP细胞再生，而NSP衍生培养物仅显示NSP细胞的再生，而非SP细胞。
图6
图6。表达CD133的神经母细胞瘤细胞表现为球形和肿瘤形成增多。
筛选CD133表达的细胞，在免疫缺陷小鼠侧翼植入5000个细胞后，检测（A）瘤球形成和（B）致瘤性。在接种后21天对肿瘤体积和频率进行量化。分子表示肿瘤侧翼的数量，分母表示注射侧翼的总数。（C） 小鼠左翼注射CD133表达细胞和右翼注射CD132空细胞的图像。
图7
图7。神经母细胞瘤瘤球表达巢蛋白，并被oHSV有效感染。
（A） 瘤球冰冻切片上巢蛋白（绿色）和DAPI联合染色（蓝色）的免疫组织化学。比例尺=10微米。（B，C）在感染后48小时，通过（B）相位对比和（C）GFP荧光显微镜对感染rQNestin34.5的神经母细胞瘤瘤球进行成像。（D，E）rQNestin34.5感染神经母细胞瘤瘤球后48小时，通过透射电镜评估，显示细胞核中的病毒核衣壳（箭头），以及获取包膜过程中细胞质中的成熟HSV颗粒（箭头）。
图8
图8。神经母细胞瘤瘤球和肿瘤起始细胞对巢蛋白靶向溶瘤HSV敏感。
（A） 感染rQNestin34.5或对照病毒rQLuc的LA-N-5批量培养细胞和肿瘤球衍生细胞的细胞毒性试验。（B） 感染rQNestin34.5或rQLuc的LA-N-5批量培养细胞和瘤球细胞的病毒复制试验。（C） LA-N-5细胞感染oHSV体外然后植入免疫缺陷小鼠体内。随着时间的推移，对动物进行肿瘤发展跟踪。
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