Functional linkage of cirrhosis-predictive single nucleotide polymorphisms of Toll-like receptor 4 to hepatic stellate cell responses

doi:10.1002/hep.22697

.2009年3月；49(3):960-8.

doi:10.1002/hep.22697。

肝硬变相关Toll样受体4单核苷酸多态性与肝星状细胞反应的功能联系

郭金生¹, 约翰尼·洛克, 冯政, 冯红, 史蒂文是的, 福田正之, 米尔科·塔罗奇, 奥利维亚·T·阿巴尔, 黄宏锦, 约翰·斯宁斯基, 斯科特·弗里德曼

附属公司

PMID： 19085953
预防性维修识别码：项目经理2891538
内政部： 10.1002/hep.22697

肝硬变相关Toll样受体4单核苷酸多态性与肝星状细胞反应的功能联系

郭金生等。肝病学. 2009年3月.

.2009年3月；49(3):960-8.

doi:10.1002/hep.22697。

作者

郭金生¹, 约翰尼·洛克, 冯政, 冯红, 史蒂文是的, 福田正之, 米尔科·塔罗奇, 奥利维亚·T·阿巴尔, 黄宏锦, 约翰·斯宁斯基, 斯科特·弗里德曼

附属

¹复旦大学上海医学院中山医院肝病科内科，中国上海。

PMID： 19085953
预防性维修识别码：项目经理2891538
内政部： 10.1002/hep.22697

摘要

在最近的一项研究中，与主要的野生型CC等位基因（p.T399）相比，Toll样受体4（TLR4）基因的单核苷酸多态性（SNP）（c.1196C>T[rs4986791，p.T399I]）表现出对纤维化进展的保护作用。本研究检测了该SNP以及另一种常见的高度共分离TLR4 SNP（c.896A>G[rs4986790，p.D299G]）与肝星状细胞（HSC）反应的功能联系。与表达WT TLR4的HSC相比，来自TLR4（-/-）小鼠的HSC和用TLR4 D299G和/或T399I互补DNA重建的人类HSC系（LX-2）的HSC对脂多糖（LPS）刺激反应较低，通过LPS诱导的炎症和趋化细胞因子（即单核细胞趋化蛋白-1、白细胞介素-6）的表达和分泌、骨形态发生蛋白的下调和激活素膜结合抑制剂的表达（抑制性转化生长因子β假受体）进行评估，以及激活核因子κB（NF-kappaB）反应性荧光素酶报告子。此外，TLR4（-/-）或髓样分化因子88（-/--）（TLR衔接蛋白）小鼠HSC中的自发凋亡以及NF-kappaB、细胞外信号调节激酶（ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶途径抑制剂诱导的凋亡显著增加，以及在表达D299G和/或T399I SNP的小鼠HSC中；这些细胞系的凋亡增加伴随着磷酸化ERK和Bcl-2的减少。

结论：与肝纤维化保护相关的TLR4 D299G和T399I单核苷酸多态性降低TLR4介导的炎症和纤维生成信号，并降低活化HSC的凋亡阈值。这些发现提供了一种机制联系，解释了特异性TLR4单核苷酸多态性如何调节纤维化进展的风险。

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数字

图1
TLR4 siRNA消除LX-2细胞的LPS反应性。在用TLR4 siRNAs单独转染后，通过实时PCR或与NF共转染进行mRNA分析-κ用于NF评估的B反应性报告质粒-κB激活后，用LPS（100 ng/mL）刺激LX-2细胞12小时。（A）转染TLR4 siRNA（TLR4-siRNA）或对照siRNA（csiRNA）的LX-2细胞中炎症细胞因子和纤维生成基因的相对mRNA表达，以应对LPS。数据是相对于不含LPS或siRNA的细胞中的表达进行描述的，这些细胞的值为1。（B） NF的折叠变化-κ转染TLR4 siRNA或对照siRNA的LX-2细胞对LPS的B反应性报告活性。数据是相对于不含LPS或siRNA的细胞中的表达进行描述的，这些细胞的值为1。TLR4 siRNA消除了LPS诱导的MCP-1和IL-6的上调以及BAMBI的下调，同时NF的反应性降低-κB活动。每列代表三个独立实验中每组n=6的平均值±SEM**P（P）*< 0.05; ***P（P）*与对照siRNA转染细胞相比，<0.01。

图2
TLR4单核苷酸多态性降低NF-κHSC对LPS刺激的B激活。一种NF-κ将B反应性报告质粒与TLR4 cDNA共转染到LX-2细胞中，或转染到与人TLR4 c DNA稳定重组的mHSC中。用LPS（100ng/mL）刺激细胞12小时。NF的激活-κ用双核糖核酸酶报告子分析系统测定B反应性报告子。（A） NF的折叠变化-κ转染TLR4 WT或SNP序列或LacZ控制载体的LX-2细胞中的B报告活性。（B） NF的折叠变化-κTLR4中的B报告人活动^−/−用TLR4 WT或SNP序列或LacZ控制载体转染小鼠HSC，并在MyD88中^−/−用WT人TLR4序列重组HSC。表达单个或双SNP的细胞NF较少-κB激活。每列代表三个以上独立实验中每组n=6的平均值±SEM**P（P）*与WT TLR4 cDNA转染的星状细胞相比，<0.05。

图3
TLR4 SNP减弱NF的反应-κLPS刺激后HSC中的B靶基因。LX-2细胞或TLR4^−/−用100 ng/mL LPS刺激用人TLR4 cDNA瞬时或稳定重组的mHSC株系12小时。实时定量PCR检测LX-2细胞（A）和mHSC（B）中炎性细胞因子MCP-1、IL-6和BAMBI的mRNA表达。ELISA法检测LX-2细胞（C）和小鼠HSC（D）细胞培养上清中MCP-1和IL-6蛋白分泌的平行变化。在单一或双重SNP存在的情况下，LPS暴露后MCP-1和IL-6 mRNA的折叠变化减少，而BAMBI下调的程度减弱。的更改α-用TLR4单核苷酸多态性重建后，平滑肌肌动蛋白和I型胶原mRNA在统计学上没有差异（未显示）。每列代表三个独立实验中每组n=6的平均值±SEM**P（P）*与WT TLR4 cDNA转染的星状细胞相比，<0.05。

图4
TLR4单核苷酸多态性通过通路抑制剂降低mHSC生长并增强生长抑制。TLR4级^−/−用PI3K抑制剂（LY 294002）、ERK抑制剂（PD 98059）或NF处理用人TLR4 cDNA稳定重组的mHSC株系-κB抑制剂（20μM、 10个μM、和5μM、分别）。DNA合成通过^三[H] -合并。（A） TLR4中的DNA合成^−/−转染人TLR4 WT或SNP cDNA和MyD88的mHSC^−/−用人TLR4 WT重组的HSC。（B）添加PI3K抑制剂、ERK抑制剂或NF后的生长减慢率-κB抑制剂。与WT TLR4细胞相比，单核苷酸多态性或双核苷酸多态性细胞的生长速度较慢，并且在路径抑制后生长减慢。每列代表三个独立实验中每组n=6的平均值±SEM**P（P）*与WT TLR4 cDNA转染的HSC相比，<0.05。

图5
TLR4单核苷酸多态性增加mHSC的自发凋亡。在TLR4中评估自发细胞凋亡^−/−通过FACS和裂解PARP的western blot分析，用人TLR4 cDNA稳定重组的mHSC株。（A） TLR4自发凋亡的FACS分析^−/−人TLR4 cDNA和MyD88转染小鼠HSC^−/−用WT TLR4重组HSC。（B）通过每个细胞系的FACS分析测定细胞凋亡率（包括早期凋亡率[R3]和晚期凋亡率[R4]）。（C）每个细胞系中分离的PARP的Western blot分析（显示了代表性的Westernblot膜和相对密度定量）。每列代表三个独立实验中每组n=3的平均值±SEM**P（P）*与WT TLR4 cDNA转染的星状细胞相比，<0.01。表达单个或双SNP的细胞比转染WT TLR4的细胞表现出更高的自发凋亡。

图6
TLR4单核苷酸多态性降低活化HSC的凋亡阈值。TLR4级^−/−用TLR4 cDNA稳定重组的mHSC细胞系要么需要血清24小时，要么与途径抑制剂（包括PI3K抑制剂（LY 294002）、ERK抑制剂（PD 98059）或NF）孵育-κB抑制剂12小时（20μM、 10个μM、和5μM、分别）。流式细胞仪检测细胞凋亡率。在血清饥饿或通路抑制条件下，表达单一或双重TLR4 SNP的细胞比表达WT TLR4的细胞具有更高的凋亡诱导率。每列代表三个独立实验中每组n=3的平均值±SEM**P（P）*与WT TLR4 cDNA转染的HSC相比，P<0.01。

图7
TLR4单核苷酸多态性改变mHSC中凋亡相关蛋白的水平。TLR4级^−/−用100ng/mL LPS刺激用人TLR4 cDNA稳定重建的mHSC系12小时。进行凋亡调节蛋白的Western blot，包括总ERK（t-ERK）、p-ERK、总Akt（t-Akt）、p-Akt、Bcl-2和Bax（代表性的Western blotted膜和相对密度定量β-肌动蛋白）。在TLR4敲除和T399I、D299G、双重D299G/T399I SNP表达的星状细胞中，调节细胞凋亡的两个关键下游效应物（p-ERK和Bcl-2）减少。该图是三个独立实验的代表**P（P）*与WT TLR4 cDNA转染的HSC相比，<0.01。^#*P（P）*与未经LPS处理的细胞相比，<0.05。

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