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比较研究
。2009年1月；12(1):44-52.
doi:10.1038/nn.2234。 Epub 2008年12月7日。

刺激胰岛素/mTOR通路延迟视网膜色素变性小鼠模型的锥体死亡

克劳迪奥·蓬佐 1, 卡尔·科纳克, 康斯坦斯·塞普科
附属公司
比较研究

刺激胰岛素/mTOR通路延迟视网膜色素变性小鼠模型的锥体死亡

克劳迪奥·蓬佐等。 自然神经科学。 2009年1月。

摘要

视网膜色素变性是一种导致失明的不治之症。一个令人困惑的方面与疾病的进展有关。虽然导致色素性视网膜炎的大多数突变都发生在视杆感光细胞特异性基因中，但视锥感光细胞也会因此类突变而死亡。为了了解非自主锥状细胞死亡的机制，我们分析了四种携带杆状特异性基因突变的小鼠模型。我们发现雷帕霉素途径的胰岛素/哺乳动物靶点发生变化，这与锥体死亡期间的自噬激活相一致。我们在其中一个模型中增加或降低了胰岛素水平，并测量了锥体的存活率。用胰岛素进行全身治疗的小鼠锥体存活时间延长，而内源性胰岛素耗竭则产生相反的效果。这些数据表明，色素性视网膜炎的非自主性视锥细胞死亡可能，至少部分是视锥细胞饥饿的结果。

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数字

图1
图1
Rho-KO突变体中的杆死亡动力学。(a–d)核膜裂解蛋白LaminA观察到杆死亡的发生(一)，裂解半胱天冬酶3(b条)（箭头：分别为洋红色和红色信号）以及TUNEL(c、 d日)（箭头：棕色信号）（蓝色a、 b条显示细胞核DAPI染色）。(d日)显示了一个视网膜平面支架，可以看到感光层。(e–h)HE染色显示ONL的减少决定了杆死亡的进展。(i–q号)通过截面分析评估杆死亡的结束阶段(i–l)或通过视网膜扁平支架(m–q（平方米）). 在Rho-KO中，控制棒死亡发生在PW5左右(一)并升级至PW25(我). 通过PW17，ONL减少为一行单元格(h、 j个)在接下来的8周内，剩余的棒死亡(j–q)用针对鸟嘌呤核苷酸蛋白α-转导蛋白（Gnat1）的抗体在进行性衰老动物切片上进行免疫荧光观察(j–l). (m–q（平方米）)视网膜平架显示免疫荧光显示的杆状物，带有针对Gnat1的抗体。(米)显示整个视网膜(n、 o个)在视神经头周围显示更高的放大倍数(第页)显示外围区域。(问)PW25处也未检测到棒段上的信号(我). 面板中显示了年龄（产后周（PW））。垂直条输入(交流，e–l)表示ONL的厚度。
图2
图2
锥死亡动力学。(一)qRT-PCR分析操作1sw椎体退化期间。变化表示为Y轴上相对浓度随时间变化的对数，而X轴表示出生后的周数。(b–h、j、k、m–o)显示视网膜扁平支架。(k个)显示视网膜切片。绿色信号表示PNA表达，红色信号表示红/绿视蛋白表达(b、 j–n)或蓝视蛋白表达(c、 d，o日). (b–d段)P35处的野生型视网膜。红色/绿色视蛋白(b条)和PNA(c、 d日)在背部和腹部检测到表达，而蓝色视蛋白(c、 d日)只在腹部检测到。(e–g，j–o（j–o）)PDE-β突变体的分析。(e–g)PNA中心至周边梯度和锥体外节缩短（OS）。在P20，在主锥死亡阶段之前，中心有较少的细长OS(e（电子）)与外围相比。(（f）)中央或外围的高倍放大(克)OS来自(e（电子）). (小时)野生型OS（中的白线f–小时标记操作系统）。(我)中央和外围区域OS长度的量化。这些数据代表了对3周龄小鼠的3个不同视网膜进行的平均15次测量。随着退化过程中OS的缩短，红/绿视蛋白定位在整个细胞体膜上，检测细胞外蛋白的PNA被还原成一个小点，附着在残留的OS上(j个)（箭头：黄色表示红色/绿色，PNA重叠）。(k个)高倍放大的锥体显示主细胞体膜上的红色/绿色定位（箭头所示）。(我)细胞体中显示红色/绿色的横截面（箭头；j–lP70）。主要在背部检测到红色/绿色视蛋白(我)在退行性变期间，而PNA(m、 n个)或蓝色视蛋白(o个)未更改(m、 n个：P21，相同比例尺；o个：第49页）。
图3
图3
(一)在4个RP小鼠模型中发现的杆和锥死亡动力学的示意图。锥死亡的开始被设置为时间零点。x轴上相应的时间窗口以周为单位。主棒死亡阶段见正文。主要锥体死亡阶段是大约85%的锥体死亡的时间。圆锥体死亡的结束阶段是此后的时间。(b条)杆和锥死亡动力学总结。时间以出生后几天（P）或出生后几周（PW）表示。(c（c）)视网膜扁平支架上的免疫荧光显示，在锥体变性期间，在4个突变体中发现红色/绿色视蛋白表达的腹侧减少。每张图片下面都显示了出生后的应变和时间。（有关野生型的更高放大倍数，请参见图2b条).
图4
图4
Affymetrix微阵列分析。(一)进行微阵列分析的4个不同突变体中的等效时间点（R：棒死亡主要阶段的大约一半；C0：锥死亡的开始；C1和C2分别是锥死亡的第一个和第二个时间点）。时间以产后天数（P）或产后周数（PW）表示。描述圆锥体死亡进程的卡通显示在相应的时间点下方。(b条)注释的195个基因的百分比分布。(c（c）)作为新陈代谢一部分的68个基因（34.9%）的分布百分比(b条).
图5
图5
野生型和变性视网膜中的p*-mTOR。除(b、 c，克)显示视网膜切片。蓝色表示细胞核DAPI染色。(a–c)野生型视网膜中的p*-mTOR水平。(一)p*-mTOR的背侧（向上）富集。右侧显示了背部和腹部区域的高倍放大，PNA检测到p*-mTOR为红色，锥体部分为绿色。(b、 c（c）)视网膜背侧切片p*-mTOR（红色信号）和PNA染色(b条)（绿色信号）或α-β-半乳糖苷酶(c（c）)（绿色信号）。β-半乳糖苷酶受人类红/绿视蛋白启动子的控制，并在所有锥体中表达（见材料和方法）。中的插图(b、 c（c）)圆锥段的放大倍数较高，表明p*-mTOR信号位于外段的下部（OS；is：内段）。(d–g)雷帕霉素治疗野生型小鼠导致腹侧红/绿视蛋白下调(e（电子）)但不是背向(d日)（红色信号）。腹蓝视蛋白(（f）)（红色信号）不受影响，PNA也不受影响(d–g)（绿色信号）。雷帕霉素治疗也不影响野生型mTOR磷酸化(克)（红色信号）。(小时–分钟)感光细胞变性期间背部p*-mTOR水平降低（红色信号）。(小时)野生型控制。(i、 j个)PDE-β突变体。在P15停棒期间开始降低(我)当OS（绿色信号：PNA）开始从视网膜色素上皮上脱落时。(我)通过P30，只有几个锥体（绿色信号：α-β-半乳糖苷酶)显示高水平的p*-mTOR（红色信号）。(k–l)其他三个突变体的背锥也有类似的减少（PNA标记为绿色的锥）。(k个)PDE-γ-KO第35页。(我)Rho-KO PW20。(米)P23H PW70。
图6
图6
锥细胞中Hif-1α和GLUT1的上调。所有面板均显示免疫荧光染色。左侧列(a、 d、g、h，)显示了视网膜平面支架和右立柱(b、 c、e、f、i、j)视网膜切片。蓝色表示细胞核DAPI染色，绿色表示标记有PNA的锥体。(a–f)HIF-1α染色（红色信号）。(一)放大倍数较高的野生型（PW10）（插图）。(b、 c（c）)野生型横截面（PW10）。(c（c）)DAPI重叠(b条). (d–f）PDE-β锥体变性期间−/−（PW10）锥体中HIF-1α水平增加(d日，插图）。(e、 （f）)横截面显示，Hif-1α的增加主要发生在锥体中（箭头指向在此阶段位于内核层顶层的锥体）。(（f）)DAPI重叠(e（电子）). (克)野生型GLUT1表达（PW10）（红色信号）。锥体之间的大多数信号反映了杆中的表达。(h–j小时)扁平坐骑退化过程中锥体中GLUT1表达增加(小时)和节(i–j). (我)的重叠(j个)带有PNA。
图7
图7
溶酶体膜LAMP-2水平升高。(a–c)视网膜扁平支架上的免疫荧光显示LAMP-2为绿色，红色/绿色视紫红质为红色，蓝色信号显示细胞核DAPI染色。右上角的插图（带方框）显示放大的单元格（箭头）。(一)PW5处的野生型视网膜显示溶酶体（小绿点），LAMP-2分布正常。在PR核水平检测到微弱的红/绿视蛋白信号，因为在野生型中，它主要存在于OS中。(b、 c（c）)PW5时PDE-β突变。(b条)由于LAMP-2在溶酶体膜上的积聚，溶酶体（圆点）扩大，具体见于锥体。(c（c）)与中相同场的共焦截面(b条)在内核层水平上测得的LAMP-2水平与野生型相似(一). (d日)3种不同LAMP-2剪接形式的qRT-PCR显示PDE-β突变体与野生型的相对浓度和比率。
图8
图8
胰岛素水平影响椎体存活率。(a–c)PDE-β突变体在PW7处的视网膜扁平镶嵌物染色用于lacZ，检测锥体（参见材料和方法以及在线补充图8）。(一)未经处理的对照示例。(b条)注射链脲佐菌素的小鼠示例。(c（c）)每天注射胰岛素的小鼠示例。(d日)治疗4周后椎体存活率的量化。数据表示至少8个视网膜的平均值，并在y轴上显示锥体表面积的百分比与整个视网膜的表面积（参见在线补充图9和10）。(e（电子）)血糖水平和体重的测量(（f）)在实验期间每周执行一次。(g、 小时)未经治疗的对照组PDE-β视网膜扁平支架上HIF-1α（红色信号）和PNA（绿色信号）的免疫荧光染色−/−(克)和PDE-β−/−用胰岛素治疗4周的小鼠(小时). 蓝色表示核DAPI。
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    1. Madrelerla SA、Palmer RW、Massof RW、Finkelstein D.色素性视网膜炎视力下降。与视野丧失的关系。眼科学杂志。1990;108:358–61.-公共医学
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