Role of JNK1-dependent Bcl-2 phosphorylation in ceramide-induced macroautophagy

doi:10.1074/jbc.M805920200

.2009年1月30日；284(5):2719-2728.

doi:10.1074/jbc。M805920200。 Epub 2008年11月23日。

JNK1依赖性Bcl-2磷酸化在神经酰胺诱导的大自噬中的作用

苏菲·帕丁格¹, Chantal Bauvy公司¹, 斯特凡·卡彭蒂尔², 蒂埃里·利瓦德², 贝斯·莱文^三, 帕特里斯·科多诺⁴

附属公司

¹INSERM U756，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 Chátenay-Marabry，France；巴黎南11大学，法医学院，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 Chátenay-Marabry，France。
²法国图卢兹31000号图卢兹第三大学INSERM U858；法国图卢兹第三大学（31000 Toulouse III University）蒙古雷·兰盖尔研究所（Institute de Médecine Moléculaire de Rangueil）。
^三德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心霍华德·休斯医学研究所，邮编75390；德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心内科，邮编75390；德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心微生物系，邮编75390。
⁴INSERM U756，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 Chátenay-Marabry，France；巴黎南11大学，法医学院，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 Chátenay-Marabry，France。电子地址：patrice.codogno@u-psud.fr。

PMID： 19029119
预防性维修识别码：项目经理2631952
DOI（操作界面）： 10.1074/jbc。805920200米

JNK1依赖性Bcl-2磷酸化在神经酰胺诱导的巨噬细胞自噬中的作用

苏菲·帕丁格等。生物化学杂志. 2009.

.2009年1月30日；284(5):2719-2728.

doi:10.1074/jbc。M805920200。 Epub 2008年11月23日。

作者

苏菲·帕丁格¹, Chantal Bauvy公司¹, 斯特凡·卡彭蒂尔², 蒂埃里·利瓦德², 贝斯·莱文^三, 帕特里斯·科多诺⁴

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¹INSERM U756，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 Chátenay-Marabry，France；巴黎南11大学，法医学院，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 Chátenay-Marabry，France。
²法国图卢兹31000号图卢兹第三大学INSERM U858；法国图卢兹第三大学（31000 Toulouse III University）蒙古雷·兰盖尔研究所（Institute de Médecine Moléculaire de Rangueil）。
^三德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心霍华德·休斯医学研究所，邮编75390；德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心内科，邮编75390；德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心微生物系，邮编75390。
⁴INSERM U756，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 Chátenay-Marabry，France；巴黎南11大学，法医学院，5 rue Jean-Baptiste Clément，92296 Chátenay-Marabry，France。电子地址：patrice.codogno@u-psud.fr。

PMID： 19029119
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DOI（操作界面）： 10.1074/jbc。805920200米

摘要

大自噬是一种液泡溶酶体分解代谢途径，在营养饥饿期间受到刺激以保持细胞完整性。神经酰胺是一种生物活性鞘脂，与多种细胞过程相关。在这里，我们表明短链神经酰胺（C（2）-神经酰胺和C（6）-神经胺）和三苯氧胺刺激从头合成神经酰胺可诱导自噬蛋白Beclin 1和抗凋亡蛋白Bcl-2之间形成的复合物分离。这种解离是神经酰胺或饥饿诱导大自噬所必需的。三个潜在的磷酸化位点，Thr（69）、Ser（70）和Ser（87），位于Bcl-2的非结构N末端环中，在Bcl-2与Beclin 1的分离中起主要作用。我们进一步表明，神经酰胺激活c-Jun N末端蛋白激酶1是磷酸化Bcl-2和刺激大自噬所必需的。这些发现揭示了鞘磷脂信号在上调参与细胞适应应激的主要细胞过程中的一个新方面。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**C类₂-Cer诱导HeLa细胞自噬。** A类、希拉GFP-LC3细胞在EBSS或完全培养基中培养4h(厘米)单独或补充100μ米C类₂-Cer或100μ米C类₂-DHCer公司。*左侧面板*，自噬通过计算具有GFP-LC3点。所示结果代表了三个独立的实验。每次分析50–100个细胞。*右侧面板*,代表性图像。B类，HeLa细胞被质粒转染编码人GFP-LC3 WT或人GFP-LC 3ΔG。转染后24小时，将细胞置于EBSS或完全培养基中4小时(厘米),单独或补充100μ米C类₂-证书或100 μ米C类₂-DHCer公司。通过计数定量自噬带有GFP-LC3或GFP-ΔG点的细胞数量。显示的结果是三个独立实验的代表。50–100个细胞每次分析。显示的结果代表了三个独立的实验。C类，HeLa细胞放置在EBSS，CM中4 h，100μ米C类₂-Cer或100μ米C类₂-DHCer公司。使用抗p62抗体（1:2000）或抗肌动蛋白抗体（1:5000）。D类,DAG法测定内源性长链神经酰胺在“材料和方法”下。报告的值是平均值±三个独立实验的S.D.。*，第页< 0.05与厘米。

**图2。**
**C类₆-Cer诱导HeLa细胞自噬。** A类、希拉GFP-LC3细胞在EBSS或完全培养基中培养4h(厘米)单独或补充100μ米C类₆-Cer或C₆-DHCer公司。*左侧面板*，自噬是通过用GFP-LC3点计数细胞数量进行量化。结果所示为三个独立实验的代表。50–100个单元格每次分析的结果。*右侧面板*，具有代表性的图像。B类，HeLa GFP-LC3细胞与CM培养24 h，1μ米Tam或1μ米Tam加100 n米粘蛋白或2.5μ米1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉-1-丙醇。*左侧面板*,通过计数带有GFP-LC3点的细胞数量来量化自噬。所示结果代表了三个独立的实验。每次分析50–100个细胞。显示的结果具有代表性三个独立实验的结果。*右侧面板*，具有代表性的图像。C类，内源性长链神经酰胺的定量，通过DAG as在“材料和方法”中描述。报告的值是三个独立实验的平均值±S.D。星号表明第页< 0.05与厘米。

**图3。**
**神经酰胺在HeLa细胞中诱导Beclin 1-Bcl-2复合物解离。** A类，HeLa细胞在EBSS或完全培养基中培养4h(厘米)单独或补充100μ米C类₆-证书，C₆-DHCer，C公司₂-证书，或C类₂-DHCer公司。用山羊免疫沉淀内源性Beclin 1多克隆抗体（1:80稀释）。免疫沉淀蛋白使用多克隆抗Bcl-2抗体进行免疫印迹。裂解物使用多克隆抗Bcl-2或多克隆抗Beclin 1进行免疫印迹抗体。B类，HeLa细胞在EBSS或CM，单独或补充1μ米Tam或1μ米Tam加100 n米粘蛋白。内源性Beclin 1是用山羊多克隆抗体免疫沉淀（1:80稀释）。免疫沉淀蛋白使用多克隆抗Bcl-2抗体。使用多克隆对裂解产物进行免疫印迹抗Bcl-2或多克隆抗Beclin 1抗体。Western印迹是代表三个独立实验。

**图4。**
**C类₂-Cer诱导自噬和Beclin/Bcl-2复合物HT-29细胞中的解离。** A类，培养HT-29 Bcl-2细胞在EBSS或完全培养基中培养4小时(厘米)补充100μ米C类₂-Cer或100μ米C类₂-DH（决断高度）证书。使用山羊多克隆免疫沉淀内源性Beclin 1抗体（1:80稀释）。免疫沉淀蛋白使用多克隆抗Bcl-2抗体进行免疫印迹。裂解物为使用多克隆抗Bcl-2或多克隆抗Beclin 1进行免疫印迹抗体。B类，蛋白质水解（参见“材料和方法”）在用CM或EBSS处理4 h的HT-29细胞中测量；或HT-29 Bcl-2中CM、EBSS处理的细胞，100μ米C类₂-DHCer或100μ米C类₂-证书。C类、HT-29和HT-29 Bcl-2细胞用编码GFP-LC3的质粒转染。转染后24小时，HT-29细胞在EBSS或CM中培养4h用CM、EBSS、100μ米C类₂-DHCer，或100 μ米C类₂-证书。通过计数定量自噬带有GFP-LC3点的细胞数量。所示结果代表了三个独立的实验。每次分析50–100个细胞。报告的数值为三个独立实验的平均值±标准偏差。星号表明第页< 0.05与厘米。

**图5。**
**C类₂-Cer刺激MCF-7中的Bcl-2磷酸化。*贝克林1*细胞。** A类，MCF-7。*贝克林1*细胞培养用于在EBSS中完全培养基中培养4小时(厘米)或在CM中补充100μ米C类₂-证书。对裂解液进行免疫印迹使用抗磷酸化Bcl-2（Ser）的单克隆抗体⁷⁰) (1:1000,*上部面板*)或小鼠单克隆抗Bcl-2抗体（1:1000，*下部面板*).B类，MCF-7。*贝克林1*个单元格用编码Bcl-2 WT、Bcl-2 AAA或Bcl-2 EEE的质粒转染。24转染后h，将细胞放置在CM或100中4 hμ米C类₂-证书。用山羊免疫沉淀Beclin 1多克隆抗体（1:80稀释）。免疫沉淀蛋白是使用多克隆抗Bcl-2抗体进行免疫印迹。裂解液是使用多克隆抗Bcl-2或多克隆抗Beclin 1进行免疫印迹抗体。C类，MCF7。*贝克林1*细胞与编码GFP-LC3的质粒、空载体或编码Bcl-2 WT的质粒，Bcl-2 AAA或Bcl-2 EEE。转染后24小时，培养细胞EBSS、CM中4小时，100μ米C类₂-Cer或100μ米C类₂-DHCer公司。自噬通过计数具有GFP-LC3点的细胞数量。显示的结果代表分析了四个独立实验±S.D.50–100个细胞每次分析。

**图6。**
**C类₂-Cer通过HeLa中JNK1活性刺激自噬细胞。** A类，HeLa细胞在EBSS中培养4h，完成介质(厘米)单独或补充100μ米C类₂-证书。用兔单克隆抗体对裂解液进行免疫印迹抗磷-JNK（Thr¹⁸³/提尔¹⁸⁵)抗体（1:1000，*上部面板*)或兔单克隆抗JNK抗体（1:1000，*下部面板*).B类，HeLa细胞与GFP-LC3、空载体或编码非活性载体的质粒编码JNK1号机组(*dnJNK1号*). 转染24小时后，对细胞进行处理使用EBSS、CM或100μ米C类₂-证书。自噬通过用GFP-LC3点计数细胞数量进行量化。结果所示为三个独立实验的代表。50–100个单元格每次分析的结果。C类，HeLa细胞被转染编码dnJNK1的质粒。转染后4h，对细胞进行处理使用EBSS，CM，100μ米C类₂-Cer或100μ米100 μ米C类₂-DHCer公司。当时的细胞用兔单克隆进行电泳和免疫印迹抗磷-JNK（Thr¹⁸³/提尔¹⁸⁵)抗体（1:1000），a兔单克隆抗JNK抗体（1:1000）或单克隆抗体针对磷酸化Bcl-2（Ser⁷⁰) (1:1000,*上部面板*)或a小鼠单克隆抗Bcl-2抗体（1:1000）。报告的值为平均值±三个独立实验的S.D。

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