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.2009年1月16日；284(3):1694-701.
doi:10.1074/jbc。M807890200。 Epub 2008年11月21日。

弓形虫诱导宿主细胞自噬并促进寄生虫生长

王玉宝 1, 路易斯·魏斯, 阿莫斯·奥洛夫斯基
附属公司

弓形虫诱导宿主细胞自噬并促进寄生虫生长

王玉宝等。 生物化学杂志. .

摘要

自噬被证明有助于防御细胞内细菌和寄生虫。相比之下，这类病原体操纵宿主细胞自噬的能力尚未得到验证。在此，我们提出证据表明，弓形虫（一种细胞内原生动物寄生虫）感染后，通过依赖于宿主Atg5但不依赖于雷帕霉素抑制宿主哺乳动物靶点的机制，在HeLa细胞和原代成纤维细胞中诱导宿主细胞自噬。感染导致LC3转化为自噬体相关形式LC3-II，导致含LC3的小泡在寄生液泡附近积聚，并导致磷脂酰肌醇3-磷酸指示剂YFP-2xFYVE标记的结构向液泡重新定位。自噬调节因子beclin 1集中在感染细胞中寄生液泡附近。抑制剂研究表明，寄生菌诱导的自噬依赖于钙信号和脱落酸。在生理相关氨基酸水平上，Atg5缺陷细胞中的寄生虫生长出现缺陷，表明宿主细胞自噬在寄生虫恢复宿主细胞营养素中起作用。流式细胞仪对细胞大小与寄生虫含量的关系进行了分析，结果表明，依赖于自噬的寄生虫生长与依赖于寄生虫进展的宿主细胞自噬消耗量相关。这些发现表明，自噬作为寄生虫与宿主细胞有效竞争限制合成代谢资源的途径发挥了新的作用。

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数字

图1。
图1。
弓形虫感染诱导宿主细胞自噬。 A类、希拉细胞被YFP表达物感染弓形虫在指定位置感染的多重性(m.o.i公司)持续2、4、8或24小时裂解产物进行免疫印迹分析。B类，HeLa细胞转染GFP-LC3，然后感染野生型弓形虫24小时后，细胞固定，荧光前用DAPI染色成像。比例尺，5微米。C类，细胞被视为B类.检测邻近和覆盖的信号寄生空泡，共焦z叠加重建图像。这个箭头表示寄生液泡。D类,HeLa或HFF细胞感染YFP-表达弓形虫用于22h，然后用或不用10μg/ml胃蛋白酶抑制素A和10μg/ml培养E64D（PepA+E64D）2 h。通过免疫印迹分析蛋白质提取物使用指示的抗体。
图2。
图2。
自噬途径成分在弓形虫-诱导的自噬。 A类，控制(重量)或atg5型-/-MEF感染了YFP-expressingT。弓形虫用胃蛋白酶抑制素A处理所示样品22小时(佩帕)免疫印迹前2小时。B类，HeLa细胞转染YFP-2×FYVE并感染野生型T。平底船在多种感染情况下持续24小时(m.o.i公司)第页，共4页。这个荧光成像前，细胞固定并用DAPI染色。这个星号表示寄生液泡。比例尺, 5微米。C类，HeLa细胞转染FLAG-Beclin 1并感染具有野生类型弓形虫在多种感染情况下持续24小时4.荧光成像前，细胞固定并用DAPI染色。箭头表示寄生液泡。N个，寄主细胞核。比例酒吧，5微米。D类，感染和对照HeLa细胞的裂解物受到免疫沉淀(IP（IP）)使用抗Beclin 1。输入（20μg）和IP样品通过SDS-PAGE进行解析，并用指示的抗体。E类，HeLa细胞转染非特异性(纳秒)或贝克林1小干扰RNA。2天后，细胞感染弓形虫24h后进行免疫印迹分析。
图3。
图3。
弓形虫-诱导的自噬与mTOR无关。 A类，对照或感染的HeLa或HFF细胞的蛋白提取物用指示的抗体进行分析。B类、野生型或tsc2型-/-MEF感染了YFP-expressingT。弓形虫24小时后，通过SDS-PAGE和用指示的抗体进行探测。对于4E-BP1tsc2型-/-MEF通过强度向最上面的带。C类，细胞被感染B类用于4或24h、 然后进行胰蛋白酶化和固定。寄生虫增殖用流式细胞仪测定每个感染细胞的寄生虫数量。m.o.i公司感染的多样性；联合国，未感染。
图4。
图4。
弓形虫-诱导的自噬是钙依赖性的。 A类，HeLa细胞转染GFP-LC3，感染YFP-表示弓形虫22小时，然后用我2SO载体（0.2%，v/v）或20μ米BAPTA-AM公司(BAP（BAP）)2小时后，细胞固定并用DAPI染色荧光成像，比例尺，5μm。B类、HeLa或HFF细胞被感染并用载体或BAPTA-AM处理A类. The用所示抗体进行免疫印迹检测。C类和D类，HeLa细胞（转染YFP-2×FYVE）为感染了弓形虫持续22小时(C类)或在培养基中培养(D类). 然后用载体处理细胞(反对的论点)或BAPTA-AM（BAP）2小时，然后固定、DAPI染色和荧光成像。这个箭头表示寄生液泡。比例酒吧，5微米。m.o.i公司感染的多样性。
图5。
图5。
氟啶酮抑制弓形虫-诱导自噬。HeLa细胞是否感染YFP表达弓形虫4小时后洗去游离的寄生虫，用载体（0.1%）处理细胞二甲基亚砜(二甲基亚砜))或50μ米培养基中的氟啶酮持续20小时。A类，蛋白质提取物进行免疫印迹并用显示抗体。印迹包括从单个样本中复制样本实验。B类，免疫印迹中LC3-II带的强度为通过密度测定法测量并归一化（未处理对照=100）。每个酒吧表示两个独立实验的平均值。m.o.i公司感染的多样性。
图6。
图6。
宿主细胞自噬在寄生虫生长中的作用。 A类,自噬在生理氨基酸水平上促进生长。MEF，或者野生型(实心圆圈)或Atg5型-/-(打开圈子)，被剥夺血清24小时，感染YFP表达弓形虫4小时，冲洗以清除游离寄生虫，然后与指示的DMEM稀释液在Hanks缓冲液中培养16小时将细胞进行胰蛋白酶化、固定，并通过流式细胞术进行分析以测量寄生虫数量/细胞。该数字用于计算寄生虫净增益减去4h时获得的值星号表明第页值<0.02。B类和C类，下感染限制性氨基酸通过自噬逐渐减少宿主细胞的大小。这个在中分析的单元格A类进行了前向散射评估(金融稳定委员会)作为寄生虫含量（YFP）的函数。B类，点图显示过夜感染后100%DMEM中wt宿主细胞的代表性样本。C类，将黄土平滑应用于包含1–20个寄生虫。前向散射值标准化为平均值每个样本中未感染细胞的值。每个曲线表示数据从一个样本的点图中。为了简单起见，只有一个代表显示12、25或50%培养细胞的样本（共三个）DMEM。这些数据代表了两个类似的实验。
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