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.2008年11月28日；283(48):33784-92.
doi:10.1074/jbc。M802431200。 Epub 2008年10月8日。

Rheb和mTOR通过Rap1B调节神经元极性

李英华 1, 亨德里克·沃纳, 安德烈亚斯·普舍尔
附属公司

Rheb和mTOR通过Rap1B调节神经元极性

李英华等。 生物化学杂志. .

摘要

具有单个轴突和多个树突的极化海马神经元的发育依赖于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和GTPase Rap1B的活性。在这里，我们表明PI3K通过GTPase Rheb及其雷帕霉素靶向哺乳动物调节轴突的规格和伸长。Rheb的过度表达诱导了多轴突的形成，而RNA干扰对其的抑制阻止了轴突的特异性。mTOR是磷酸化eIF4E结合蛋白（如4E-BP1）的翻译中央调节器。通过抑制mTOR和mTOR不敏感4E-BP1突变体的表达抑制轴突形成。抑制PI3K或mTOR可降低作用于Rheb和mTOR下游的Rap1B水平。泛素E3连接酶Smurf2通过启动其降解来调节Rap1B的限制。通过RNA干扰抑制Smruf2能够补偿Rheb的损失。这些结果表明，在建立神经元极性的过程中，需要mTOR通路来抵消Rap1B的Smurf2启动降解。

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图1。
图1。
神经元极性需要Rheb和mTOR活性。 A类，显示了PI3K/Rheb/mTOR途径的概述。PI3K推广通过抑制作为GTPase的Tsc1·Tsc2复合物进行翻译Rheb激活蛋白(17).B、，神经元用EGFP和pSuper载体（对照）或pSb102在0天静脉内转染（针对Rheb的shRNA载体），并在3次静脉注射后用Tau-1染色(蓝色)和反MAP2(红色)抗体。C类-E、，没有轴突的神经元的百分比单轴突和多轴突(C类)，轴突的长度(D类)以及每个神经元的小突起数量(E类)是显示（平均值±S.E。；*,第页<0.001与pSuper；n个> 100).F、，溶剂（DMSO）或200 n米雷帕霉素(卢比)3～5h后加入神经元。神经元在静脉注射3天后用Tau-1染色(绿色，轴突标记）和抗MAP2抗体(红色，小神经突）。Axons被鉴定为在其远端显示Tau-1免疫反应的突起。MAP2阳性突起长于一个细胞直径被分类为树枝晶（平均值±S.E.，三个独立实验；*,第页与对照组（DMSO）相比<0.001；n个> 150).G、，雷帕霉素在3d.i.v.下引起的极性缺陷的定量在不同浓度下(n个=每种情况200-250个神经元）。不延伸任何轴突的神经元被归类为非极化神经元。这个比例尺为20μm。
图2。
图2。
Rheb表达诱导多轴突。 A类，个神经元用EGFP或EGFP和Rheb质粒进行0次静脉注射转染(绿色)并在静脉注射3天后用Tau-1染色(蓝色)和抗MAP2(红色)抗体。Tau-1-阳性轴突的标记为星号.细胞体(2)和两个轴突(1和三)对于具有多轴突。B类-E类，没有轴突（0），具有单个轴突(1)还有多个轴突(>1) (B类)，轴突的长度(C类)，数量小神经突(D类)和小神经突的长度(E类)显示EGFP或Rheb表达后（平均值±S.E。；*,第页< 0.001 (B类和D类)或<0.005(C类)与EGFP相比；n个> 90). 这个比例尺是20微米。
图3。
图3。
Rheb作用于PI3K下游和mTOR上游。 A、，用EGFP或EGFP和Rheb质粒对神经元进行0 d.i.v.转染(绿色)，在二甲基亚砜存在下培养，100μ米LY294002型(年)，或200 n米雷帕霉素(卢比)和用Tau-1染色(蓝色)和反MAP2(红色)抗体。B类和C、，百分比没有轴突的神经元(0)，只有一个轴突(1)、和有多个轴突（>1) (B类)和轴突的长度(C类)显示（平均值±S.E。；*,第页<0.001与EGFP比较或在括号;n个> 70). 这个比例尺为20μm。
图4。
图4。
mTOR不敏感4E-BP1突变体的表达阻断轴突形成和Rheb的影响。 A、，用载体转染神经元4E-BP1周(4E-BP1型)，Δ24-4E-BP1myc（Δ24),HA4E-BP1或HA4E-BP 1-AA在0 d.i.v.下固定，并用myc标签特异性抗体(绿色)，地图2(红色)，或Tau-1抗体(蓝色).B类和C类，百分比没有轴突的神经元(0)，只有一个轴突(1)、和有多个轴突（>1) (B类)和轴突的长度(C类)显示（平均值±S.E。；*,第页<0.001 (B类)或<0.005(C类)与GFP比较；n个> 100).D类和E类，神经元转染载体用于4E-BP1myc(4E-BP1型)或Δ24-4E-BP1myc（Δ24)上的0次静脉注射，固定在3次静脉注射上，并用myc特异性抗体染色tag、MAP2或Tau-1抗体。没有轴突的神经元百分比(0)，有一个轴突(1)还有多个轴突(>1) (D类)和轴突的长度(E类)显示（平均值±S.E。；*,第页< 0.001 (B类)或<0.005 (C类)与4E-BP1相比；n个> 80). 这个比例尺为20μm。
图5。
图5。
胰岛素诱导雷帕霉素敏感性的多轴突形成方式。 A、，用EGFP载体转染神经元观察其形态，并在电镀后4h用200n个米胰岛素(Ins公司)，200牛顿米Ins和200n个米雷帕霉素(卢比，在胰岛素前20分钟添加或车辆，并用Tau-1染色(蓝色)和反MAP2(红色)抗体。B类和C、，没有轴突的神经元百分比(0)，带有单轴突(1)和多轴突（>1)(B类)和轴突的长度(C类)显示（平均值±S.E.公司。；*,第页与对照组或值由指示括号;n个> 100). 这个规模酒吧为20μm。
图6。
图6。
PI3K/mTOR途径的作用取决于Rap1B。 A类,极化神经元与指定浓度的胰岛素孵育(Ins公司，个米)，雷帕霉素（n米,卢比)，或LY294002（μ米,年)在表达通过Western blot在2.5 d.i.v.下分析Rap1B和RhoA。装载用抗微管蛋白染色证实了相当数量的蛋白质抗体。B类，神经元在0 d.i.v.上用载体转染EGFP或HA-标记Rheb(绿色)和pSHAG RNAi载体(控制)或针对Rap1B的shRNA载体，并在3与Tau-1的直接投资(蓝色)和反MAP2(红色)抗体。C类和D类，没有轴突的神经元百分比(0)，只有一个轴突(1)还有多个轴突(>1) (C类)和轴突的长度(D类)显示了（平均值±S.E。；*,第页与对照组相比<0.001或在括号;n个> 100).这个比例尺为20μm。
图7。
图7。
Rap1B作用于mTOR和Rheb的下游。 A、，神经元用EGFP或myc标记的Rap1BV12载体进行0次静脉注射转染，处理使用溶剂（DMSO）或雷帕霉素(印尼卢比)转染后，以及用Tau-1和抗MAP2抗体进行3次静脉注射染色。百分比没有轴突的神经元(0)，有一个轴突(1)、和有多个轴突（>1) (B类)显示（平均值±S.E.公司。；*,第页与溶剂相比<0.001(DMSO公司)或括号所示值之间；n个>100).B类，用EGFP载体对神经元进行0 d.i.v.转染（对照）或myc-tagged Rap1BV12(绿色)和pSHAG RNAi载体（对照）或针对Rheb（Rheb RNAi）的shRNA载体，用Tau-1染色(蓝色)和反MAP2抗体(红色).C类，没有轴突的神经元百分比(0)，只有一个轴突(1)还有多个轴突(>1)显示（平均值±S.E。；*,第页<与对照组相比或在括号;n个> 100). 这个比例尺是20微米。
图8。
图8。
抑制Smurf2拯救了Rheb的损失。 A类和B类，用EGFP载体对神经元进行0 d.i.v.转染(绿色)和针对Rheb的shRNAs(Rheb RNAi，RB),蓝色2(蓝精灵2号RNAi，S2)如图所示。作为控件，向量shRNAs与不抑制Rheb的靶序列不匹配(Rheb RNAi突变，对照在里面A类和B类)或蓝色2(Smurf2 RNAi突变，对照在里面A类和中B类)使用。用Tau-1对神经元进行3次静脉注射染色(蓝色)和一个抗MAP2抗体(红色). 轴的标记为星号。B、，没有轴突的神经元的百分比(0)，只有一个轴突(1)和多轴突（>1)显示（平均值±S.E.公司。；*,第页与对照组相比<0.001(Rheb RNAi基因多用途终端+蓝f2 RNAi mut)).
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