JNK1-mediated phosphorylation of Bcl-2 regulates starvation-induced autophagy

doi:10.1016/j.molcel.2008.06.001

.2008年6月20日；30(6):678-88.

doi:10.1016/j.molcel.2008.06.001。

JNK1介导的Bcl-2磷酸化调节饥饿诱导的自噬

魏永杰¹, 苏菲·帕丁格, 桑吉塔·辛哈, 迈克尔·巴斯克, 贝斯·莱文

附属公司

PMID： 18570871
预防性维修识别码：项目经理2478643
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.molcel.2008.06.001

JNK1介导的Bcl-2磷酸化调节饥饿诱导的自噬

魏永杰等。分子电池. 2008.

.2008年6月20日；30(6):678-88.

doi:10.1016/j.molcel.2008.06.001。

作者

魏永杰¹, 苏菲·帕丁格, 桑吉塔·辛哈, 迈克尔·巴斯克, 贝斯·莱文

附属

¹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心霍华德·休斯医学院，邮编75390。

PMID： 18570871
预防性维修识别码：第478643页
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.molcel.2008.06.001

摘要

饥饿诱导自噬，以维持几乎所有真核生物的细胞内环境稳定。然而，饥饿诱导自噬的机制尚不完全清楚。在哺乳动物细胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2在非神经支配状态下与Beclin 1结合并抑制其自噬功能。这里我们表明饥饿诱导非结构环的残基T69、S70和S87处细胞Bcl-2的磷酸化；Bcl-2与Beclin 1的解离；和自噬激活。相反，缺乏磷酸化位点非结构环的Bcl-2病毒在饥饿期间无法与Beclin 1分离。此外，应激激活的信号分子c-Jun N末端蛋白激酶1（JNK1）（而非JNK2）介导饥饿诱导的Bcl-2磷酸化、Bcl-2与Beclin 1的分离和自噬激活。总之，我们的研究结果表明，JNK1介导的Bcl-2多位点磷酸化通过破坏Bcl-2/Beclin 1复合物刺激饥饿诱导的自噬。这些发现定义了细胞用于调节自噬活动以响应营养状态的机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。饥饿调节细胞而非病毒Bcl-2和Beclin 1之间的相互作用**
（A） Flag表位标记的KSHV vBcl-2与Beclin 1在HeLa细胞或MCF7中的共免疫沉淀。*贝克林1*用表达Flag-vBcl-2的质粒转染细胞，并在正常培养基（正常）或HBSS中培养4小时（饥饿）。（B） Myc表位标记的细胞Bcl-2与Beclin 1在HeLa细胞或MCF7中的共同免疫沉淀。*贝克林1*用表达Myc-Bcl-2的质粒转染细胞，并在正常培养基（正常）或HBSS中培养4小时（饥饿）。

**图2。饥饿刺激Bcl-2多位点磷酸化**
（A）人类Bcl-2和KSHV vBcl-2的基于结构的序列比对。每个序列的残留物编号显示在校准块中。黄色、粉红色和红色背景表示序列保守性增强，相同的残基用粗体白字突出显示。α-螺旋和线圈二级结构，由BH域彩色编码，显示在每个排列上方。红色三角形表示人类Bcl-2非结构环内的磷酸化位点。（B–C）P检测³²HeLa细胞和MCF7中磷酸化内源性Bcl-2的代谢标记。*贝克林1*MCF7中的细胞（B）或磷酸化Bcl-2。*贝克林1*转染野生型或突变型Myc-Bcl-2（C）的细胞。细胞在正常培养基（饥饿-）或HBSS中培养4小时（饥饿+）后溶解，用抗Bcl-2（B）或抗Myc（C）免疫沉淀，用SDS-PAGE分离，并用所示抗体进行放射自显影或Western blot分析。（D）使用MCF7中磷酸特异性抗人Bcl-2（Ser70）抗体检测磷酸化Bcl-2。*贝克林1*转染野生型或突变型Myc-Bcl-2的细胞。细胞在正常培养基（饥饿-）或HBSS中培养4小时（饥饿+），然后裂解。更快的迁移带表示Bcl-2丝氨酸70上的单侧磷酸化，较慢的迁移带（箭头）表示多位点磷酸化。

**图3。Bcl-2磷酸化位点突变改变Bcl-2/Beclin 1结合的调控**
（A和B）在MCF7中与Beclin 1共免疫沉淀Bcl-2。*贝克林1*细胞（A）或HeLa细胞（B）转染表达野生型或指定突变型Myc-tagged Bcl-2的质粒，并在正常培养基（饥饿-）或HBSS中生长4小时（饥饿+）。（C） MCF7中Beclin 1与嵌合病毒/细胞Bcl-2构建物的共免疫沉淀。*贝克林1*用表达嵌合体的质粒转染带有野生型或指示突变细胞Bcl-2环插入物的细胞，并在正常培养基（饥饿-）或HBSS中培养4小时（饥饿+）。

**图4。Bcl-2磷酸化位点突变改变自噬调节**
（A） MC7饥饿期间GFP-LC3染色的代表性图像。*贝克林1*细胞与GFP-LC3共转染并显示质粒。箭头表示含有GFP-LC3点的代表性细胞（即自噬体结构）。（B和C）MCF7自噬的光镜定量。*贝克林1*用GFP-LC3和质粒共转染的细胞在x轴下显示。In（B）质粒表达野生型或指示突变细胞Bcl-2。In（C）质粒表达嵌合病毒/细胞Bcl-2，其中vBcl-2的氨基酸24-34被来自野生型或指示突变细胞Bcl-2的氨基酸25-95取代。所示结果代表每件样品中超过100个细胞的三份样品的平均值±SEM。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。

**图5。内源性*jnk1型*是饥饿诱导的Bcl-2磷酸化、Bcl-2/Beclin 1复合物分解和自噬所必需的**
（A和B）MCF7中活性JNK（A）和活性P38（B）的Western blot分析。*贝克林1*在正常培养基（饥饿-）或HBSS中培养4小时（饥饿+）的细胞，使用多克隆山羊抗JNK抗体通过免疫沉淀法检测活性JNK，然后使用兔多克隆Thr183/Tyr185磷酸化特异性JNK免疫印迹分析（a，上图）。通过兔多克隆磷酸化P38 MAP激酶（Thr180/Tyr182）抗体（B，上面板）检测到活性P38。用兔多克隆JNK和P38 MAP激酶抗体分别检测JNK总量和P38（A–B，下表）。（C） Beclin 1联合免疫沉淀与野生型（WT）中Bcl-2（顶面板）、Bcl-2磷酸化（第四面板）和JNK磷酸化（第一面板）的比较，*jnk1型*^−/−和*jnk2型*^−/−MEFS在正常培养基（饥饿-）或HBSS中生长4小时（饥饿+）。其他面板表示通过Western blot分析使用所示抗体在细胞裂解液中检测到的Beclin 1（第二面板）、Bcl-2（第三面板）、JNK1（第六面板）和JNK2（底部面板）的总量。（D） WT中p62/SQSTM1水平的比较，*jnk1型*^−/−和*jnk2型*^−/−在正常培养基（饥饿-）或在HBSS中生长4小时（饥饿+）期间的MEFS。Actin显示为加载控件。

**图6。组成活性和显性负性JNK1调节Bcl-2磷酸化、Bcl-2与Beclin 1的结合和饥饿诱导的自噬**
（A）组成活性JNK1和显性阴性JNK1.对MCF7中Bcl-2磷酸化（上面板）和Bcl-2与Beclin 1共同免疫沉淀（第二面板）的影响。*贝克林1*细胞在正常培养基（饥饿-）或HBSS中生长4小时（饥饿+）。下面板表示通过Western blot分析使用指示抗体在细胞裂解液中检测到的Beclin 1（第三面板）、Bcl-2（第四面板）、MKK7-JNK1（第五面板）或活性MKK-JNK1（MKK-P-JNK1）（第六面板）的总量。（B） MCF7中GFP-LC3染色的代表性图像。*贝克林1*细胞与GFP-LC3共转染并显示质粒。箭头表示含有GFP-LC3点的代表性细胞（即自噬体结构）。（C和D）MCF7自噬的光镜定量。*贝克林1*与GFP-LC3和质粒共同转染的细胞显示在x轴下方。所示结果代表每件样品中超过100个细胞的三份样品的平均值±SEM。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。

**图7。饥饿和JNK1通过内质网定位的Bcl-2池的多位点磷酸化和内质网Bcl-2/Beclin-1复合物的破坏来调节自噬**
（A）营养条件和组成活性JNK1对WT Bcl-2 MEF或AAA Bcl-2 EMF中Bcl-2磷酸化（第五组）和Beclin 1与Bcl-2（上组）共同免疫沉淀的影响。正常介质中的增长表示为“饥饿-”，HBSS中的增长则表示为“饥荒+”。其他面板表示通过Western blot分析使用所示抗体在细胞裂解液中检测到的Beclin 1（第二面板）、Bcl-2（第三面板）或Flag-MKK7-JNK1（第六面板）的总量或抗Bcl-2免疫沉淀的Bcl-2的总量（第四面板）。（B）与GFP-LC3和质粒共同转染的WT bcl-2 MEFs和AAA bcl-2 MEFs自噬的光镜定量显示在x轴下方。实心条代表正常培养基中的生长，开放条代表HBSS中四小时的生长（营养缺乏）。所示结果代表每件样品中超过100个细胞的三份样品的平均值±SEM。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。（C）营养条件和组成活性JNK1对WT Bcl-2 MEF中重膜（HM，线粒体）、轻膜（LM，ER）或胞浆（Cytol）组分中Bcl-2磷酸化（顶面板）和Beclin 1与Bcl-2（第二面板）共同免疫沉淀的影响。正常介质中的增长表示为“饥饿-”，HBSS中的增长则表示为“饥荒+”。其他面板表示通过Western blot分析使用所示抗体在细胞裂解液中检测到的Beclin 1（第三面板）、Bcl-2（第四面板）、Flag-MKK7-JNK1（底部面板）、Calreticulin（ER标记，第五面板）或Tim 23（线粒体标记，第六面板）的总量。

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1. Blagosklonny MV.解开Bcl-2磷酸化环。白血病。2001;15:869–874.-公共医学
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