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.2008年9月；15(9):1460-71.
doi:10.1038/cdd.2008.81。 Epub 2008年6月13日。

未折叠蛋白反应调节因子GRP78/BiP是哺乳动物细胞内质网完整性和应激诱导自噬所必需的

J李 1, M镍, B李, E巴伦, D R提示, A S李
附属公司

未折叠蛋白反应调节因子GRP78/BiP是哺乳动物细胞内质网完整性和应激诱导自噬所必需的

J李等。 细胞死亡差异. 2008年9月.

摘要

在哺乳动物细胞中，内质网（ER）应激最近被证明可以诱导自噬，而诱导需要未折叠蛋白反应（UPR）信号通路。然而，目前尚不清楚自噬是否调节UPR通路，以及特定的UPR靶点如何控制自噬。在此，我们证明，尽管ER应激诱导的自噬被III类磷脂酰肌醇-3'-激酶（PI3KC3）抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）、沃特曼和使用小干扰RNA（siRNA）敲低Beclin1抑制，但只有3-MA抑制UPR激活。我们发现，应激诱导的自噬需要UPR调节因子和ER伴侣GRP78/BiP。在GRP78表达被siRNA抑制的细胞中，尽管UPR通路和LC3转化自发激活，内质网应激和营养饥饿诱导的自噬体形成受到抑制。GRP78被击倒并没有破坏PI3KC3-Beclin1关联。然而，对细胞内细胞器结构的电子显微镜分析表明，内质网是产生自噬体双层膜的假定膜源，在GRP78被敲除的细胞中大量扩张和紊乱。众所周知，ER的扩增依赖于UPR转录因子XBP-1。GRP78和XBP-1的同时敲低恢复了应激诱导的自噬体形成的正常水平。因此，这些研究揭示了3-MA是UPR激活的抑制剂，并确定GRP78是哺乳动物细胞自噬的一种新的必需成分。

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数字

图1
图1
内质网应激诱导内源性LC3转化和自噬体形成。(一)用thapsigargin（TG，2μM）或tunicamycin（Tun，3μM）处理HEK293细胞指定的时间。通过Western blot分析细胞裂解物的LC3转化率（LC3-I，18kDa；LC3-II，16kDa）、CHOP和GRP78诱导以及β-肌动蛋白（作为负荷对照），依次使用抗体。(b条)每个细胞自噬体的定量。瞬时转染GFP-LC3的HeLa细胞要么未经处理（NT），要么营养缺乏（NS）2h，要么用TG（2μM）、Tun（3μM）或BFA（2.5μg/ml）处理4h。对于每种情况，检查15到35个细胞。实验重复进行了3次。将结果汇总并表示为平均值和指示的标准偏差。(c（c）)HEK293细胞的代表性电子显微照片，非处理（NT）、NS处理2小时或Tun处理（3μM）5小时。自噬体用黑色箭头表示，ER用白色箭头表示，N=细胞核；棒材=1μm。(d日)自噬空泡的放大图像如所示(c（c）)来自NS和Tun处理的细胞；棒材=0.2μm。
图2
图2
3-MA抑制内质网应激诱导的自噬抑制UPR。(一)HEK293细胞未经处理（NT）或用3-甲基腺嘌呤（3-MA，10 mM）或沃特曼（WM，100 nM）预处理1 h。然后，在没有或持续存在3-MA或WM的情况下，对细胞进行NS处理2 h、TG（2μM）或Tun（3μM）处理4 h。通过Western blot连续使用抗体分析细胞裂解液中LC3-I转化为LC3-II、CHOP、GRP78和β-肌动蛋白的水平。(b条)HEK293或HeLa细胞与(一). 通过Western blot连续使用抗体分析细胞裂解液中CHOP、ATF4、GRP78和β-actin的表达。(c（c）)与相同(b条)除细胞用沃特曼预处理外。(d日)HEK293细胞未经处理（0 h）或用3-MA（10 mM）预处理1 h，然后用Tun（3μM）处理，在没有或持续存在3-MA的情况下处理指定时间。分析细胞裂解液中磷酸化-JNK1（p-JNK1）、JNK1-、磷酸化-eIF2α（p-eIF2α）和eIF2β的水平。此外，提取总RNA并分析其表达Xbp-1型，拼接Xbp-1型(Xbp-1型)和β-肌动蛋白（作为对照）。(e（电子）)HEK293细胞未经处理（0小时）或在Tun处理前用wortmannin（100 nM）预处理，并测定Xbp-1型拼接，如所述(d日). 对于所有面板，实验重复2至3次。
图3
图3
Beclin1是内质网应激诱导的自噬所必需的，但不用于UPR激活。用对照siRNA（siCtrl）或siRNA转染HEK293细胞贝克林1（siBec）。细胞未经处理（NT）或用TG（2μM）或Tun（3μM）处理5h(一)分析细胞裂解液中LC3-I转化为LC3-II、Beclin1和β-actin的水平（作为负荷控制），或(b条)CHOP、Beclin1和β-actin通过Western blot依次使用抗体。(c（c）)将SiRNA转染的HEK293细胞用Tun（3μM）处理指定时间。依次使用抗体通过蛋白质印迹分析细胞裂解物的p-JNK1和JNK1水平。提取总RNA并分析其表达Xbp-1型,Xbp-1型和β-肌动蛋白（作为对照）。(d日)p-JNK1水平的定量如所示(c（c）)在Tun治疗期间，用siCtrl或siBec转染细胞的JNK1总水平正常化后。(e（电子）)CHOP和Xbp-1型用siCtrl或siBec转染的细胞中的剪接。本实验中使用了较低浓度的TG（0.3μM）。同时监测Beclin1和β-actin的水平。
图4
图4
GRP78敲除自发激活UPR并损害细胞活性。(一)用40 nM siCtrl或siRNA转染HEK293细胞以对抗人类组78（siGrp78）48 h。通过Western blot依次使用抗体分析细胞裂解液中GRP78、GRP94、钙网蛋白（CRT）和β-actin（作为负荷控制）或CHOP、PDI和β-attin的表达。实验重复2次。(b条)在用40 nM siCtrl或siGrp78转染48 h后，HEK293细胞接受克隆形成存活试验。siCtrl转染细胞的存活率设为100%。显示标准偏差，*，p<0.05。(c（c）)用40 nM siCtrl或siGrp78转染HEK293细胞48 h。然后用Tun（3μM）处理细胞指定时间。使用抗体分别通过Western blot分析细胞裂解物的p-JNK1和JNK1或GRP78和β-actin水平（作为负荷对照）。提取总RNA并分析Xbp-1型,Xbp-1型和β-肌动蛋白（作为对照）。(d日)p-JNK1的水平如所示(c（c）)定量，针对JNK1进行标准化，并用未处理（0小时）、siCtrl转染的细胞中的相对水平绘制，设定为1。
图5
图5
GRP78敲除阻断内质网应激或NS诱导的自噬体形成。(一)将GFP-LC3单独（−）或与40 nM的siCtrl或siGrp78联合瞬时转染HeLa细胞。然后，将细胞非处理（NT）或用Tun（3μM）处理4小时。显示荧光显微镜捕获的活细胞中GFP-LC3点状斑点形成的典型图像。(b条)细胞自噬体形成的定量(一). 总结了3个独立实验的结果，并用所示SD表示为平均值(c（c）)Western blot分析GRP78、GRP94和β-肌动蛋白（作为负荷控制）蛋白水平(一). (d日–（f）)与相同(一–c（c）)不同之处在于细胞要么未经处理（NT），要么接受NS。(克)用40 nM的siCtrl或siGrp78转染HeLa细胞，在没有或存在zVAD-fmk（40μM）的情况下进行NS处理2 h，TG或Tun处理4 h，如上图所示。Western blot检测LC3-I和II、CHOP和β-actin水平。实验重复2次。
图6
图6
GRP78敲除破坏ER完整性，但不破坏PI3KC3-Beclin1复合物的形成。(一)用抗Beclin1抗体免疫沉淀来自siRNA转染的HEK293细胞的细胞裂解物。免疫复合物的PI3KC3和Beclin1水平通过Western blot依次使用抗体进行分析。通过Western blot连续使用抗体分析部分细胞裂解物的GRP78、PI3KC3和Beclin1表达。(b条)用pcDNA3（载体控制，vec）或指定量的pcDNA3-His-GRP78（His-GRP78）转染HEK293细胞。免疫沉淀、免疫复合物分析以及His-GRP78、PI3KC3和Beclin1的表达与(一). (c（c）)转染siCtrl的细胞的代表性电子显微照片（左面板）显示稀疏的ER结构（白色箭头）或siGrp78（右面板）显示内腔扩张的ER结构增加（白色箭头。N、 细胞核；棒材=1μm。(d日)用siCtrl或siGrp78转染细胞的细胞质内质网区域的定量。标准偏差如所示，*，p<0.0001。(e（电子）)敲除XBP-1恢复了GRP78敲除抑制的应激诱导自噬体形成的正常水平。所示siRNA与GFP-LC3瞬时共转染到HeLa细胞中。这些细胞要么是未经处理的（NT），用Tun（3μM）处理4h，要么是NS处理2h。在每种条件下，用荧光显微镜检测自噬体的形成并进行定量。实验重复2次。将结果汇总并表示为平均值和指示的标准偏差。插入物显示了分别转染siCtrl（第1道）、siGrp78（第2道）、siXbp-1（第3道）和siGrp78+siXbp-1的细胞中GRP78、XBP-1和β-actin水平的Western blot分析。
图7
图7
3-MA和GRP78对人类细胞中UPR信号和自噬途径的调节。营养饥饿（NS）和内质网应激导致LC3转化和自噬体形成。这一步需要Beclin1，它是PI3KC3的交互式合作伙伴。用3-MA处理细胞阻断NS和ER应激诱导的LC3转化，以及ER应激对UPR的激活。相反，用沃特曼或敲除Beclin1处理细胞可以阻断营养素和ER应激诱导的LC3转化，但对UPR激活没有影响。据报道，JNK活化和eIF2α磷酸化可诱导LC3转化，导致自噬。GRP78的敲除导致内质网应激、UPR通路激活以及内质网大规模扩张和紊乱。在GRP78缺失的细胞中，Beclin1和PI3KC3之间的复合物形成完整，LC3转化略微增强。然而，NS和ER应激诱导的自噬体形成受到抑制。
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