跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2008年5月；4(5):295-305.
doi:10.1038/nchembio.79。

mTOR依赖性自噬途径中亨廷顿病的新靶点

安德里亚·威廉姆斯 1, Sovan Sarkar公司, 保罗·卡顿, 伊万杰利亚·克托菲, Shinji Saiki先生, 法拉·H·西迪奇, 卢卡·贾利斯, 安吉丽·弗莱明, 迪安·帕斯克, 保罗·戈德史密斯, 卡希尔·J·奥凯恩, 罗德里戈·安德烈斯·弗洛托, 大卫·C·鲁宾斯泰因
附属公司

mTOR依赖性自噬途径中亨廷顿病的新靶点

安德里亚·威廉姆斯等。 自然化学生物. 2008年5月.

摘要

自噬是导致亨廷顿病等疾病的细胞内聚集倾向蛋白的主要清除途径。mTOR抑制剂雷帕霉素的自噬诱导加速了这些有毒底物的清除。由于雷帕霉素具有非同寻常的副作用，我们筛选了FDA批准的药物，以确定新的自噬诱导途径。我们发现L型钙通道拮抗剂、K+ATP通道开放剂米诺地尔和G（i）信号激活剂可乐定可诱导自噬。这些药物揭示了调节自噬的周期性mTOR依赖性途径，其中cAMP调节IP3水平，影响钙蛋白酶活性，钙蛋白酶活性通过裂解和激活G（s）α完成周期，G（sα调节cAMP水平。该途径有许多可能诱导自噬的潜在点，我们利用哺乳动物细胞、苍蝇和斑马鱼模型为亨廷顿病的治疗相关性提供了原理证明。我们的数据还表明，升高细胞内Ca2+（如兴奋毒性）的损伤抑制自噬，从而延缓聚集倾向蛋白的清除。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。自噬诱导药物的鉴定。
a、，表达A53Tα-synuclein的稳定诱导PC12细胞系中A53T a-synuclein清除率与肌动蛋白相关的密度分析。用强力霉素诱导转基因表达48小时，然后用药物（均为1μM）或二甲基亚砜（载体对照）治疗24小时（通过去除强力霉素）关闭转基因表达。控制条件设置为100%。误差线：平均值的标准误差。b中，表达EGFP-HDQ74的稳定诱导PC12细胞系中可溶性EGFP-HD Q74清除率与肌动蛋白的密度分析。用强力霉素诱导转基因表达8小时，然后用药物（均为1μM）或二甲基亚砜（载体对照）治疗96小时（通过去除强力霉素）。控制条件设置为100%。误差条：平均值的标准误差。c、，转染EGFP-HDQ74构建物的SK-N-SH细胞转染4 h后，用药物（均为1μM）或DMSO（载体对照）处理48 h。EGFP阳性细胞聚集或细胞死亡的比例表示为优势比，对照组为1。误差条：95%置信区间。日期：，用可乐定、米诺地尔和维拉帕米（均为1μM）或DMSO（载体对照）处理PC12细胞24小时。用抗LC3抗体检测内源性LC3-II水平，并相对于肌动蛋白进行定量。雷帕霉素（0.2μM）为阳性对照。误差线：平均值的标准误差。e、，野生型EGFP-HDQ74聚集体中EGFP阳性细胞的比例(附件5+/+)和淘汰赛(ATG5型−/−)Atg5小鼠胚胎成纤维细胞，转染EGFP-HDQ74 4 h，然后用药物（均为1μM）或DMSO（载体对照）处理48 h。误差线：95%置信区间。***，对<0.001; **,对<0.01; *,对<0.05; NS，不重要。
图2
图2。咪唑啉-1受体激动剂通过cAMP作用于Rap2B和PLC-ε调节自噬。
a、，稳定PC12细胞中A53Tα-突触核蛋白清除率如图1a所示，使用或不使用1μM利尔梅尼定、1 mM二丁基cAMP（db-cAMP）、24μM福斯克林或500μM 2′5′二脱氧腺苷（2′5’ddA）处理24小时。注意，由于印迹的不同暴露，给定底物的控制清除水平可能因图而异，这有助于说明增加或延缓清除的药剂。b中，如图1c所示，在SK-N-SH（用于利美尼定）和COS-7（用于db-cAMP，forskolin，2′5′ddA）中，EGFP阳性细胞与EGFP-HDQ74聚集体的比例，用图2a转染后48小时。误差线：95%置信区间。c、，用1μM利美尼定或500μM 2′5′ddA处理PC12细胞24 h后内源性LC3-II水平。日期：，如图1a所示，用或不用8-CPT-2Me-cAMP或6-Bnz-cAMP（1μM或10μM）处理的稳定PC12细胞中的A53Tα-突触核蛋白清除率。e、，EGFP阳性COS-7细胞与聚集物的比例如图1c所示，转染后48小时用或不用10μM 8-CPT-2Me-cAMP或6-Bnz-cAMP处理。误差线：95%置信区间。f、，将EGFP-HDQ74与空载体（pcDNA3.1）、显性阴性S17N Rap2B（DN Rap2B）或野生型PLC-ε（1:3比率）一起转染COS-7细胞4小时，评估48小时后EGFP阳性细胞与聚集物的比例。误差条：95%置信区间。克，在表达48小时后，评估转染显性阴性Rap2B（DN-Rap2B）4小时的COS-7细胞中内源性LC3-II水平。h时，将EGFP-HDQ74与空载体（pcDNA3.1）或显性阴性Rap2B（1:3比例）转染4 h的EGFP阳性COS-7细胞与聚集物的比例，用或不用10μM 8-CPT-2Me-cAMP处理48 h。误差条：95%置信区间。我，COS-7细胞，转染EGFP-HDQ74和dsRed2或细胞溶质dsRed2-IP三在转染后48小时评估激酶A（1:3比率）的聚集和细胞死亡（如图1c所示）。误差线：95%置信区间。***，对<0.001; **,对<0.01; *,对<0.05; NS，不重要。
图3
图3。L-型钙的作用2个+通道激动剂对自噬和突变体亨廷顿蛋白聚集的抑制作用被钙蛋白酶抑制所抵消。
a、，用10、15或20μM钙蛋白酶抑制剂预处理SK-N-SH细胞15分钟，然后添加1μM（±）-Bay K8644 4小时。用抗钙蛋白酶小亚基抗体免疫印迹法检测钙蛋白酶活性。密度测定分析是相对于肌动蛋白的。误差线：平均值的标准误差。b中，用EGFP-HDQ74转染SK-N-SH细胞4小时，然后用或不用10、15或20μM钙Pastatin预处理15分钟，然后在转染后加入1μM（±）-Bay K8644 48小时，评估EGFP阳性细胞与EGFP-HDQ74聚集体的比例。误差线：95%置信区间。c、，SK-N-SH细胞在加入或不加入10、15或20μM钙蛋白酶抑制剂的情况下预处理15分钟，然后加入1μM（±）-Bay K8644，处理4小时。用抗LC3抗体免疫印迹法检测内源性LC3-II水平。日期：，钙蛋白酶活性、EGFP-HDQ74聚集和自噬体之间的比较如图3a-c所示。所有评估的对照条件设置为100%。Calpastatin以剂量依赖性的方式降低了（±）Bay K8644引起的钙蛋白酶活性和EGFP-HDQ74聚集增加，同时LC3-II水平（自噬体）增加。e、，用空载体（pcDNA3.1）或野生型PLC-ε转染COS-7细胞4 h，并在转染后48 h用或不用50μM钙肽处理，评估EGFP阳性细胞与EGFP-HDQ74聚集体的比例。误差线：95%置信区间。***，对<0.001; **,对<0.01; *,对<0.05; NS，不重要。
图4
图4。钙蛋白酶抑制增加聚集倾向的蛋白质清除。
a、，EGFP阳性SK-N-SH细胞与EGFP-HDQ74聚集或细胞死亡的比例如图1c所示，在转染后48小时内用或不用10μM钙蛋白酶抑制剂、50μM ALLM或50μM钙肽肽处理。DMSO是ALLM和钙肽的对照。误差线：95%置信区间。b中，HeLa细胞转染EGFP-HDQ74构建物和siGLO公司（对照siRNA）在有或无钙蛋白酶1或钙蛋白酶2 siRNA（1:3比率）的情况下持续96小时GLO公司-如图1c所示，对阳性细胞进行聚集和细胞死亡评估。误差线：95%置信区间。c、，HeLa细胞，转染siGLO公司用抗钙蛋白酶1或抗钙蛋白酶2结构域III抗体分析96小时内钙蛋白酶1和钙蛋白酶2的（对照siRNA）或siRNA。日期：，如图1b所示，经药物处理后，可溶性EGFP-HDQ74在稳定PC12细胞中的清除率（浓度为图4a)96小时。密度测定与肌动蛋白有关。误差线：平均值的标准误差。e、，未分化或非有丝分裂神经分化（含100 ng/ml神经生长因子5 d）稳定PC12细胞的A53Tα-突触核蛋白清除，如图1a所示，用或不用10μM钙蛋白酶抑制剂处理24 h。密度测定与肌动蛋白有关。误差线：平均值的标准误差。f、，将EGFP-HDQ74与空载体（pcDNA3.1）或组成活性（CA）m-calpain（1:3比率）转染COS-7细胞48小时，评估其聚集和细胞死亡，如图1c所示。误差线：95%置信区间。克，随后用二甲基亚砜（对照）、1μm维拉帕米或1μm可乐定处理转染EGFP-HDQ74和空载体（pcDNA3.1）或组成活性m-calpain（1:3比例）的SK-N-SH细胞48小时。EGFP阳性细胞与聚集物的比例如图1c所示。误差线：95%置信区间。***，对<0.001; **,对<0.01；*，对<0.05.
图5
图5。钙蛋白酶抑制诱导自噬。
a、，用EGFP-HDQ74和pcDNA3.1（空载体）转染的EGFP阳性MEFs与聚集体的比例附件5+/+细胞，或转染EGFP-HDQ74和pcDNA3.1、WT Atg5或K130R Atg5构建物ATG5型−/−细胞4小时（1:3比例），然后用或不用10μM钙蛋白酶抑制剂处理48小时。所有数据均来自同一个实验，但特定实验中参考条件的优势比设置为1，以便于比较。ATG5型−/−与对照组相比，细胞EGFP-HDQ74聚集物增加附件5+/+单元格。误差线：95%置信区间。b中，用si转染HeLa细胞GLO公司（对照组）加入或不加入calpain 1 siRNA或calpain 2 siRNA（比例1:3）96 h，然后用EGFP-LC3构建物转染4 h。再过2 h后固定细胞。评估含有>5个EGFP-LC3小泡的转染细胞的比例。误差线：95%置信区间。c、，经或不经10μM或30μM钙蛋白酶抑制剂处理24小时后，SK-N-SH细胞内源性LC3-II水平。日期：，用400 nM巴非霉素A1处理稳定表达EGFP-LC3的HeLa细胞4小时，并加入或不加入10μM钙蛋白酶抑制剂、50μM ALLM或50μM钙肽。钙蛋白酶抑制剂在添加巴非霉素A1之前处理24小时。用抗EGFP抗体检测EGFP-LC3-II。不同钙蛋白酶抑制剂的数据来自不同的印迹。e、，用myc-LC3和EGFP-C1转染带有pcDNA3.1（空载体）或组成活性（CA）m-calpain（1:1:3比率）的COS-7细胞4 h，转染24 h后用抗myc抗体免疫印迹分析LC3-II水平。误差线：平均值的标准误差。f、，用EGFP-LC3和pcDNA3.1（空载体）转染COS-7细胞，或组成活性m-calpain（1:3比例）转染4小时，转染24小时后固定，评估EGFP阳性细胞中含有>5个EGFP-LC3小泡的比例。误差线：95%置信区间。***，对<0.001; **,对<0.01; *,对<0.05; NS，不重要。
图6
图6。钙蛋白酶裂解物Gsα在cAMP和Ca之间创建链接2个+-钙蛋白酶途径。
a、，稳定PC12细胞中的A53Tα-突触核蛋白清除率，如图所示。1a，用或不用100nM PACAP，用或不用10μM calpastatin或500μM 2′5′ddA处理24小时。b中，用1μM PACAP或200μM NF449处理48小时后，SK-N-SH细胞中EGFP阳性细胞与聚集物的比例如图1c所示。误差线：95%置信区间。c、，用pcDNA3:1（空载体）或组成型活性（CA）m-calpain和EGFP-HDQ74（3:1比例）转染的COS-7细胞中的聚集4小时，然后用或不用500μM2′5′ddA处理48小时。误差条：95%置信区间。日期：，转染对照或G的HeLa细胞sα对72小时的siRNA进行G分析sα用抗-G免疫印迹法测定水平sα抗体。在转染对照或G基因的HeLa细胞中评估聚集sαsiRNA和EGFP-HDQ74持续72小时。误差线：95%置信区间。e、，转染对照或G基因的HeLa细胞内源性LC3-II水平sαsiRNA 72小时。f、，经或不经200μM NF449处理24小时的PC12细胞内源性LC3-II水平。克，转染对照或G基因的HeLa细胞内源性LC3-II水平sαsiRNA 72小时，最后4小时用或不用400 nM巴非霉素A1处理。密度分析与肌动蛋白有关。误差线：平均值的标准误差。h时，转染对照或G的EGFP阳性HeLa细胞与聚集物的比例sαsiRNA持续48小时，然后与pcDNA 3.1（空载体）或组成活性（CA）m-calpain和EGFP-HDQ74（3:1比率）一起再转染48小时。误差条：95%置信区间。***，对<0.001; **,对<0.01; *,对<0.05; NS，不重要。
图7
图7。钙蛋白酶对自噬的调节是mTOR依赖性的。
a、，用EGFP-HDQ74和rheb或pcDNA3.1（空载体）（1:3比例）转染4 h，转染后48 h用或不用10μM钙蛋白酶抑素或50μM钙肽素处理后，EGFP阳性COS-7细胞聚集或细胞死亡的比例。评估钙蛋白酶抑制剂在rheb转染细胞中的作用的对照条件为1。误差线：95%置信区间。b中，转染EGFP-LC3和pcDNA3.1（空载体）或rheb（1:3比例）4 h，转染后24 h用或不用10μM钙蛋白酶抑素或50μM钙肽素处理的EGFP阳性COS-7细胞的比例大于5个囊泡。误差线：95%置信区间。c、，转染EGFP-HDQ74和组成活性（CA）m-calpain或pcDNA3.1（空载体）（1:3比例）的EGFP阳性COS-7细胞与聚集物的比例，转染后48小时用或不用0.2μm雷帕霉素处理。误差线：95%置信区间。日期：，用EGFP-LC3和组成型活性（CA）m-calpain或pcDNA3.1（空载体）（1:3比例）转染4小时，并在转染后用或不用0.2μm雷帕霉素处理24小时，EGFP阳性COS-7细胞与>5个EGFP-LC3囊泡的比例。误差线：95%置信区间。e、 f、，EGFP阳性的COS-7细胞中具有聚集体（e）和细胞死亡（f）的比例如图所示。1c，用或不用0.2μM雷帕霉素、10μM钙帕汀或两者处理48小时。误差条：95%置信区间。克，可溶性EGFP-HDQ74在稳定PC12细胞中的清除，如图1b所示，在48小时的切换期内，用或不用0.2μM雷帕霉素、10μM钙蛋白酶抑素或两者处理。误差条：平均值的标准误差。h时，如图1a所示，经0.2μM雷帕霉素、10μM钙蛋白酶抑素或两者同时处理8 h后，稳定PC12细胞中A53Tα-突触核蛋白的清除率。误差线：平均值的标准误差。***，对<0.001; **,对<0.01; *,对<0.05; NS，不重要。
图8
图8。L型钙2个+通道拮抗剂、咪唑啉-1受体激动剂、cAMP拮抗剂和钙蛋白酶抑制剂可挽救斑马鱼的亨廷顿病表型。
a、，Western blot显示，9 d.p.f.时EGFP-HDQ71诱导的视杆感光细胞变性，如缺乏单体（～36 kDa）和二聚视紫红质（～72 kDa。在这些浓度下，未观察到斑马鱼的一般毒性。b中，与野生型（WT）非转基因对照相比，EGFP-HDQ71的表达显著降低了视紫红质的表达水平。3μM（±）-BayK8644进一步消除了这种影响，而3μM维拉帕米、100μM 2′5′ddA、3μM可乐定和1μM钙蛋白酶抑制剂均能保护视杆感光细胞变性。误差线：平均值的标准误差。c、，斑马鱼眼睛切片的放大亮场和EGFP图像，在每个指定处理的腹缘区拍摄（浓度如图8b)，如图所示。棒材，10μm。日期：，计算8×12μm截面上的总聚集物数量，并与EGFP-HDQ71 DMSO处理的对照组进行比较。3μM（±）-Bay K8644显著增加了聚集负荷，而3μM维拉帕米、1μM钙蛋白酶抑制剂、3μM可乐定和100μM 2′5′ddA降低了聚集负荷。在我们的细胞模型中，这些聚集体不溶于4%的triton/SDS。误差线：平均值的标准误差。***，对<0.001; **,对<0.01; *,对<0.05.e、，涉及cAMP-Ca的mTOR依赖性自噬途径的示意图2个+-钙蛋白酶-Gsα具有多个药物靶点。细胞内cAMP水平通过腺苷酸环化酶（AC）活性增加，从而激活Epac，Epac随后激活Rap2B，Rap2B是一种激活PLC-ε的小G蛋白，导致IP的产生三和随之而来的Ca2个+从内质网释放。细胞内钙2个+L型钙也会增加其水平2个+通道激动剂。细胞内钙增加2个+激活钙蛋白酶，从而裂解并激活Gsα激活腺苷酸环化酶以增加cAMP水平，从而形成环。该途径的激活抑制自噬。在该途径的不同位置作用的多个药物靶点诱导自噬，如咪唑啉-1受体（I1R）激动剂（可乐定和利美尼定）和腺苷酸环化酶抑制剂（2′5′ddA），它们降低cAMP水平，降低肌醇和IP三水平[卡马西平（CBZ）和丙戊酸（VPA）]，L型钙2个+通道拮抗剂（维拉帕米和洛哌丁胺）、钙蛋白酶抑制剂（钙蛋白酶抑制剂和钙肽）和Gsα抑制剂（NF449）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Rubinsztein DC、Gestwicki JE、Murphy LO、Klinsky DJ。自噬的潜在治疗应用。Nat.Rev.药物发现。2007;6:304–312。-公共医学
    1. Klonsky DJ，Emr SD。自噬作为细胞降解的调节途径。科学。2000;290:1717–1721。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Rubinsztein DC公司。亨廷顿病动物模型的教训。趋势Genet。2002;18:202–209.-公共医学
    1. Gafni J，Ellerby LM。亨廷顿病患者的钙蛋白酶激活。《神经科学杂志》。2002;22:4842–4849.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gafni J等。抑制亨廷顿蛋白的钙蛋白酶裂解可降低毒性：在细胞核中积累钙蛋白酶/半胱氨酸天冬氨酸酶片段。生物学杂志。化学。2004;279:20211–20220.-公共医学

出版物类型