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.2008年2月8日；4（2）：e25。
doi:10.1371/journal.ppat.0040025。

小鼠γ-疱疹病毒68 BCL-2抑制自噬和凋亡的结构和生化基础

Bonsu Ku公司 1, Jae-Sung Woo先生, 华裔科学家梁澄玉, Kwang-Hoon Lee（李光勋）, Hyang-Suk Hong公司, 小飞E, 金钥匙（Key-Sun Kim）, Jae U Jung先生, 炳夏哦
附属公司

小鼠γ-疱疹病毒68 BCL-2抑制自噬和凋亡的结构和生化基础

Bonsu Ku公司等人。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

所有γ-疱疹病毒都表达抗凋亡B细胞淋巴瘤-2（BCL-2）的同源物，以对抗宿主抗病毒防御机制清除受感染细胞。为了深入了解这些病毒BCL-2蛋白的作用机制，我们对小鼠γ-疱疹病毒68的病毒BCL-1 M11与前自噬Beclin1和BCL-2同源物3（BH3）片段的相互作用进行了结构和生化分析从一系列促凋亡BCL-2家族蛋白中提取的含域肽。M11主要通过疏水相互作用结合Beclin1的BH3样结构域，解离常数为40毫摩尔，与细胞BCL-2和Beclin2之间的1.7毫摩尔结合亲和力相比，亲和力明显更强。一直以来，M11抑制NIH3T3细胞自噬的效率高于BCL-2。M11还与BAK的BH3结构域肽以及仅上游BH3蛋白BIM、BID、BMF、PUMA和Noxa的那些紧密相互作用，但与BAX的那些弱相互作用。这些结果共同表明，M11除了以与细胞BCL-2相似但不同的方式广泛中和促凋亡BCL-2家族外，还有效抑制Beclin1，并且Beclin1-介导的自噬可能是病毒的主要靶点。

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数字

图1
图1。M11–Beclin1（101–150）配合物的结构和结合分析
（A） 功能区绘图（左）和曲面表示（右）。M11为粉红色，而Beclin1螺旋线为绿色。初级序列图上的粉红色和绿色区域表示用于结构测定的M11和Beclin1片段。“HT”、“CCD”和“ECD”分别表示疏水尾结构域、螺旋结构域和进化保守结构域。Beclin1只有19个氨基酸显示出明确的电子密度。省略Beclin1螺旋的M11表面呈现表明BH3结合槽主要是疏水性的。表面着色方案如下：Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met和Ala的橄榄色；黄色代表Cys、Gly、Tyr和Pro；灰色代表其他氨基酸。（B） Beclin1结合导致M11构象发生较大变化。为了清晰起见，仅显示了M11的BH3结合槽区域。Beclin1（101-150）结合M11（粉红色）和游离M11（青色）叠加。结合的Beclin1肽呈绿色。M11的螺旋α3经历了明显的构象变化。箭头表示M11中Asp59和Tyr60的Cα原子的运动。（C） ITC分析。通过将0.1mM的M11滴定到5μM的指示Beclin1片段中进行测量。这个K（K） D类根据添加的配体每摩尔积分热量的曲线拟合推导出数值，并汇总在表中。（D） M11与内源性Beclin1相互作用。用HA标记的M11转染NIH3T3细胞，用全细胞裂解物进行抗HA免疫沉淀，然后用抗Beclin1免疫印迹
图2
图2。Beclin1有一个BH3-样结构域，包含非典型苏氨酸和暴露的疏水补丁
（A） M11–Beclin1（101–150）（左）和BCL-X的结构比较L（左）–不良综合体（右）。M11和BCL-XL（左）显示为曲面模型。木条中显示的Beclin1和BAD残基对应于五个BH3残基，它们对与抗凋亡BCL-2家族成员的相互作用至关重要[21]。它们在两个结构物的BH3结合槽处占据同等位置。表面着色方案如下：Val、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp、Met和Ala为黄色；蓝色代表Lys、Arg和His；红色代表Glu和Asp；灰色代表其他氨基酸。（B） 小鼠Beclin1的BH3-样结构域与各种BH3结构域的序列比较。保存的残留物以红色或粉红色列突出显示。箭头表示（A）中所示的五个BH3残留物。其中，Beclin1的Thr117（红色箭头）不保守。（C） 序列对齐。Beclin1同源基因的BH3-样结构域是对齐的（mm，小鼠；hs，人类；xl，非洲爪蟾；tr，红色Takifugu；dm，黑腹果蝇；sc，酿酒酵母）。顶部的箭头表示BH3残留物，如（A）所示。这些残基在所有物种中都高度保守，除了Beclin1小鼠的Thr117，它只在脊椎动物中保守。结构中暴露的Beclin1保守疏水残基由底部的蓝色箭头指示。（D） α-螺旋轮表示。与M11结合的Beclin1α-螺旋与与BCL-X结合的BADα-螺旋进行了比较L（左）Beclin1螺旋与BAD螺旋不同，在BH3结合槽的另一侧有一个疏水补丁（用星号表示）。
图3
图3。M11与Beclin1的相互作用比BCL-2和BCL-X紧密得多L（左）
（A） ITC分析。通过将0.1 mM M11或BCL-2滴定到5μM所示Beclin1片段中进行测量。这个K（K） D类这些值是从每摩尔添加配体的积分热的曲线拟合中推导出来的。（B） M11–Beclin1接口比BCL-X接口更紧密L（左）–Beclin1.M11–Beclin 1片段（左）和BCL-X的结构L（左）–Beclin1肽（右）并排进行比较。在这两种结构中，结合α螺旋和M11或BCL-X侧链的五个一致BH3残基L（左）与这些残留物的相互作用显示为棍子并标记。值得注意的是，Beclin1的N末端区域与M11的α3螺旋的相互作用比BCL-X中的相应区域更紧密L（左）–Beclin1螺旋线（用虚线圆圈表示）。
图4
图4。M11比BCL-2更有效地抑制NIH3T3细胞自噬体的形成
（A） 自噬的光镜定量。在用GFP–LC3表达质粒和编码所示蛋白的载体转染细胞后，将细胞保持在正常条件下或用2μM雷帕霉素处理4小时。M11（AAA）是一种M11突变体，在BH3结合槽处含有三个丙氨酸替换。自噬被量化为GFP–LC3阳性细胞的百分比（顶部）或每个细胞的自噬体数量（GFP–LCD阳性点）（底部）。M11的表达导致GFP–LC3阳性细胞或斑点少于BCL-2的表达。数据表示三个实验的平均值±标准差。M11、M11（AAA）和BCL-2的表达水平如下所示。（B） 雷帕霉素处理细胞的共焦显微图像。使用倒置荧光显微镜检测GFP–LC3。箭头表示GFP–LC3标记的自噬体。（C） 剂量反应。将GFP–LC3表达质粒转染NIH3T3细胞，同时增加编码所示蛋白的质粒数量。在转染后16–18小时，细胞接受2μM雷帕霉素处理4小时，并按照（A）所述定量自噬水平。（D） LC3机动性转换。用抗LC3和抗微管蛋白抗体对雷帕霉素处理的细胞的全细胞裂解液进行免疫印迹（左）。还显示了量化的谱带强度的比率（右）。未检测到LC3前体（LC3-I）的裂解形式（LC3-II），并且与表达BCL-2的细胞相比，表达M11的细胞中LC3-II/LC3-I的水平要低得多。数据表示三个实验的平均值±标准差。**，P（P）<0.005与矢量（学生t吨测试）。
图5
图5。M11或BCL-2蛋白与BAX/BAK相互作用的分析
（A） 基于细胞的结合分析。将HA-标记的BAK或标记的BAX与GST-标记的前生存BCL-2蛋白一起转染293T细胞。使用全细胞裂解物用抗GST进行免疫沉淀，然后用抗HA或抗Flag进行免疫印迹。虽然在本次运行中未检测到GST–KSHV BCL-2与Flag–BAX相互作用的带，但在另一次运行中检测到微弱带（图S5）。（B） ITC分析M11与BAX或BAK的BH3肽的相互作用。通过将0.1 mM的指示肽滴定为5μM的M11进行ITC分析。显示了用于滴定26米BAK肽的ITC运行。推导出的K（K） D类值显示在表中。（C） M11与内源性BAK相互作用。用HA标记的M11转染NIH3T3细胞，用全细胞裂解物与对照兔血清或抗BAK进行免疫沉淀，然后用抗HA进行免疫印迹。
图6
图6。M11与BH3-Only蛋白质BH3肽相互作用的ITC分析
显示了具有代表性的ITC运行M11与Noxa和BAD肽的相互作用，并且K（K） D类表中总结了通过该方法确定的值。
图7
图7。M11作用机构模型
本研究中的结合分析表明，M11通过同时抑制细胞凋亡和自噬来对抗细胞死亡。表示M11负调控的箭头的不同厚度表示根据K（K） D类在本研究中确定的值，并显示在箭头旁边。虚线表示BAX可能被M11抑制，但抑制程度很弱。尽管图中未显示，但受M11保护的细胞BCL-2蛋白可能隔离并抑制BAX（见正文）。PI（3）KCIII和UVRAG分别代表III类磷脂酰肌醇3-激酶和紫外线辐射抗性相关基因。
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