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.2008年2月;4(2):151-75.
doi:10.4161/auto.5338。 Epub 2007年11月21日。

高等真核生物自噬监测分析的使用和解释指南

丹尼尔·克林斯基 1哈盖·阿贝利奥维奇Patrizia Agostinis公司德文德拉·K·阿格拉瓦尔Gjumrakch Aliev公司大卫·S·阿斯克Misuzu Baba公司埃里克·贝克尔本·A·巴尔安德烈亚·巴拉比奥布鲁斯·A·班伯黛安·巴沙姆埃托雷·贝加米尼毕晓宁马丁·比亚德·皮查奇克珍妮斯·布鲁姆Dale E Bredeson公司杰弗里·L·布罗茨基约翰·布鲁梅尔Ulf T Brunk公司Wilfried Bursch公司纳丁·卡穆格兰爱德华多·塞博莱罗弗朗西斯科·塞科尼陈英玉李慎琴奥古斯汀·崔查琳·T·楚Jongkyeong Chung先生彼得·G·H·克拉克罗伯特·S·B·克拉克史蒂文·克拉克科琳·克拉维约翰·克利夫兰帕特里斯·科多诺玛丽亚·科伦坡安娜·科托·蒙特斯詹姆斯·克雷格安娜·玛丽亚·库尔沃贾扬塔·德伯纳弗朗西丝卡·德马奇帕特里克·B·丹尼斯菲利普·A·丹尼斯德雷蒂奇罗德尼·J·德文尼什费德里卡·迪萨诺J弗雷德·戴斯玛丽安·迪菲格里亚萨维萨拉马·迪内什-库马尔克拉克·W·迪斯特霍斯特莫伊甘·贾瓦赫里·梅格尼(Mojgan Djavaheri-Mergny)弗兰克·C·多尔西沃尔夫博士米歇尔·德隆威廉·A·邓恩迈克尔·杜森科N托尼·艾莎兹武伦·埃拉扎尔奥黛丽·埃斯普拉廷埃瓦·利萨·埃斯克林拉斯洛·费苏斯金·D·芬利何塞·M·富恩特斯胡安·福约藤崎浩三布里吉特·加略特汾标高大卫·A·格维茨斯宾塞·B·吉布森安捷·戈拉阿尔弗雷德·L·戈德堡拉蒙冈萨雷斯克里斯蒂娜·冈萨雷斯-埃斯特韦斯莎伦·戈尔斯基罗伯塔·戈特利布迪特尔·哈辛格优文和金·海登里奇(Kim Heidenreich)约瑟夫·希尔玛丽亚·海耶·汉森荀虎黄伟邦岩崎明子Marja Jäättelä威廉·杰克逊姜学军盛侃金泰耶·约翰森Jae U Jung先生莫托尼·卡多瓦基Chanhee Kang(康昌熙)阿梅埃塔·凯莱卡大卫·H·凯塞尔简·A·K·W·基尔红皮金(Hong Pyo Kim)阿迪·泡菜蒂莫西·金塞拉基里尔·基塞利约夫北本胜彦埃尔温·克内赫特小松MasaakiEiki Kominami公司近藤诚司Attila L Kovács酒店吉多·克罗默恰伊宽拉凯什·库马尔蒙迪拉·昆都雅克·兰德里玛丽安·拉波特伟东乐欢瑶蕾迈克尔·J·勒纳多贝斯·莱文安德鲁·利伯曼Kah-Loong Lim公司傅成林Willisa Liou先生勒罗伊·F·刘加布里埃尔·洛佩斯·贝雷斯坦卡洛斯·洛佩斯·奥廷陆波凯·F·麦克劳德沃尔特·马洛尼维姆·马丁内特Ken Matsuoka(肯·松冈)约瑟夫·莫特纳阿尔弗雷德·梅耶尔艾丽西亚·梅伦德斯保罗·米歇尔斯乔瓦尼·米奥托威廉·P·米斯蒂安Noboru水岛巴哈利亚·莫格拉比Iryna Monastyrska公司迈克尔·N·摩尔保拉·莫雷拉森山由纪夫托马什·莫蒂尔克里斯蒂安·慕尼黑利昂·O·墨菲纳威德一世(Naweed I Naqvi)托马斯·普·纽费尔德西野一藏拉尔夫·尼克松野田毅伯恩德·纽恩堡小川美其娜(Michinaga Ogawa)南希·L·奥利尼克劳拉·奥尔森布伦特·奥兹波拉特Shoshana Paglin公司格伦·帕尔默伊斯多拉·帕帕西德里Miles Parkes公司大卫·H·珀尔穆特乔治·派瑞毛罗·皮亚琴蒂尼罗尼特·平卡斯·克拉玛斯基马克·普莱斯考特塔苏拉·普罗卡斯·塞尚尼娜·拉本阿卜杜勒哈克·拉米富尔维奥·雷吉奥里巴贝尔·罗勒大卫·C·鲁宾斯泰因凯文·M·瑞恩佐岛纯一Sakagami广岛酒井雅史马可·桑德里佐川千弘米克洛斯·萨斯克劳迪奥·施奈德Per O Seglen公司Oleksandr Seleverstof公司杰弗里·萨特曼约翰·沙卡欧文·M·夏皮罗安德烈·西伯尼伊莱恩·C·M·席尔瓦·扎卡林汉斯·尤·西蒙克里斯蒂亚诺·西蒙安妮·西蒙森马克·史密斯凯萨琳娜·斯潘埃尔·布罗夫斯基维克兰·斯里尼瓦斯梅雷迪斯·斯蒂夫斯哈拉尔德·斯坦马克根据E Stromhaug卡洛斯·苏巴斯特杉本清一郎大卫·苏尔泽铃木俊彦米歇尔·斯旺森伊拉·塔巴斯竹下文彦尼古拉斯·塔尔博特兹索尔特·塔洛奇田中庆二田中角三伊塞·塔尼达格雷厄姆·泰勒J保罗·泰勒阿列克谢·特曼吉安卢卡·特塔曼蒂克雷格·B·汤普森迈克尔·图姆阿维瓦·托尔科夫斯基莎伦·A·图兹雷·特朗特Lesya V图马诺夫斯卡内山雅雄上野隆Néstor L Uzcátegui公司艾达·范德克莱伊伊娃·C·瓦奎罗维莱迈克尔·沃格尔王洪刚保罗·韦伯斯特约翰·威利奚志军(音)古田晓约阿希姆·亚哈洛姆杨金明乔治·雅普尹晓明吉森田松(Tamotsu Yoshimori)李煜岳振宇久崎美助奥尔加·扎比尔尼克郑晓祥朱雄伟罗素·L·德特
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高等真核生物自噬监测分析的使用和解释指南

丹尼尔·克林斯基等。 自噬. 2008年2月.

摘要

自噬研究继续加速,(1)因此许多新科学家正在进入该领域。因此,重要的是建立一套标准的标准来监测不同生物体中的宏自噬。最近的审查描述了用于此目的的分析范围。(2,3)有许多有用且方便的方法可用于监测酵母中的宏自噬,但在其他模型系统中相对较少,并且在高等真核生物中测量宏自噬的可接受方法方面存在很多混淆。需要强调的一个关键点是,监测自噬体数量的测量值与通过自噬途径测量通量的测量值之间存在差异;因此,需要将导致自噬体积累的宏自噬阻滞与包括向溶酶体(在大多数高等真核生物中)或液泡(在植物和真菌中)传递和降解在内的全功能自噬区分开来。在这里,我们提出了一套选择和解释方法的指南,这些方法可供试图检查宏观自噬和相关过程的研究人员以及需要对研究这些过程的论文提供现实合理评论的审查人员使用。这套指南并不意味着是一套公式化的规则,因为适当的分析部分取决于提出的问题和使用的系统。此外,我们强调,没有一种单独的检测方法可以保证在任何情况下都是最合适的,我们强烈建议使用多种检测方法来验证自噬反应。

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数字

图1
图1
图示模型,显示当周转受阻时诱导自噬体形成,而不是正常自噬流量。(A) 诱导导致自噬的启动,包括吞噬细胞的形成,吞噬细胞是最初的隔离室,它扩展为自噬体。例如,由于与溶酶体融合受阻或溶酶体功能中断而导致的自噬体周转缺陷将导致自噬小体数量增加。在这种情况下,自噬已经被诱导,但没有或只有有限的自噬通量。这与(B)中所示的情况不同,在(B)中,自噬体形成后与溶酶体融合并降解内含物,从而使整个通路完全流通。
图2
图2
LC3-I转换和LC3-II营业额。(A) HEK293和HeLa细胞在富含营养的培养基(含有10%FCS的DMEM)中培养,或在饥饿条件下(Krebs-Ringer培养基)在没有(−)或存在(+)E64d和胃蛋白酶抑制素的情况下培养4小时(抑制剂)。然后通过SDS-PAGE对细胞进行裂解,并对蛋白质进行解析。免疫印迹法检测内源性LC3。指示LC3-I和LC3-II的位置。在没有溶酶体蛋白酶抑制剂的情况下,饥饿会导致LC3-II的数量适度增加(HEK293细胞),甚至减少(HeLa细胞)。抑制剂的使用表明,这种明显的减少是由于溶酶体依赖性降解所致。该图是根据之前发布的参考数据修改的,并经Landes Bioscience许可复制,版权所有2005。(B) 饥饿期间LC3-I和LC3-II的表达水平。Atg5型+/+(野生型)和附件5−/−MEF在不含氨基酸和血清的DMEM中培养指定时间,然后使用抗LC3抗体和抗微管蛋白抗体进行免疫印迹分析。将E64d(10μg/ml)和pepstatin A(10μg/ml)加入培养基中。指示LC3-I和LC3-II的位置。与(A)中的结果类似,溶酶体蛋白酶抑制剂的加入表明,LC3-II的明显减少是由于溶酶体降解所致,通过比较同一时间点有无抑制剂的样品很容易看出这一点(抑制剂存在时的总体减少可能反映了抑制剂随着时间的推移而降低的有效性)。在分析中不包括抑制剂的情况下,通过跟踪LC3-II的稳态量来监测自噬,可能会导致对自噬没有发生的错误解释(由于明显缺乏LC3-II)。相反,如果LC3-II水平较高,但抑制剂的存在没有变化,这可能表明诱导发生了,但自噬的最后步骤被阻断,导致该蛋白稳定。该图是根据之前发布的参考数据修改的,并经Landes Bioscience许可复制,版权2007。
图3
图3
自噬诱导后LC3和GFP-LC3定位的变化。(A) 小鼠成纤维细胞和人T细胞的免疫荧光。所示细胞未经处理或用100μM雷帕霉素处理4小时,并用抗LC3的选择性抗体进行免疫荧光。T细胞中LC3染色的自噬小室用箭头表示。对20个与此处显示的细胞相似的细胞进行定量分析表明,雷帕霉素处理的细胞每个成纤维细胞有165±8个小泡,每个T细胞有6±2个小泡。棒材,5μm。该图之前曾作为参考出版,经Landes Bioscience许可复制,版权2007。(B) 稳定MEF转化子中的直接荧光。表达GFP-LC3附件5+/+附件5−/−MEF在含有10%FBS或不含氨基酸的DMEM和血清中培养1.5 h。细胞用3%PFA固定,并用荧光显微镜进行分析。棒材,20μm。此图先前发表时作为参考,经Landes Bioscience许可复制,版权所有2007。
图4
图4
GFP::LGG-1是一种自噬标记物秀丽线虫GFP::LGG-1在(A)野生型N2动物和(B)动物皮下缝细胞中的表达daf-2(e1370)自噬增加的动物。箭头所示为标志自噬前体和自噬体结构的典型GFP阳性点状区域。这个数字是根据之前发表在Meléndez A、Tallóczy Z、Seaman M、Eskelinen E-L、Hall DH、Levine B中的数据修改的。自噬基因对于幼崽的发育和寿命延长至关重要秀丽线虫《科学》2003;301:1387–91. 经AAAS许可重印。
图5
图5
GFP-LC3处理可用于监测自噬体膜的递送。附件5−/−在Tet-off启动子控制下表达Atg5的MEF在强力霉素(10 ng/ml)存在下生长一周以抑制自噬。然后在不含药物的情况下培养细胞达到指定的时间,最后饥饿或不饥饿2小时。蛋白裂解产物用抗LC3和抗GFP抗体进行western blot分析。显示了GFP-LC3-I、GFP-LC3-II和自由GFP的位置。这一数字是根据之前发表在参考文献中的数据修改的,FEBS Letters,580,Hosokawa N,Hara Y,Mizushima N,《四环素调节自噬和自噬在控制细胞大小中的作用的细胞系的生成》,第2623-9页,版权2006,经Elsevier许可。
图6
图6
自噬过程中p62蛋白的调节。(A) 饥饿期间p62的水平。附件5+/+附件5−/−MEF在不含氨基酸和血清的DMEM中培养指定时间,然后使用抗p62抗体(Progen Biotechik)进行免疫印迹分析。该图之前曾作为参考出版,经Landes Bioscience许可复制,版权2007。(B) 神经细胞特异性Atg5基因敲除小鼠大脑中p62的水平。这张图片是由Taichi Hara博士(东京医科牙科大学)慷慨提供的。
图7
图7
烟草BY-2细胞大自噬的检测。(A) 在氮限制条件下诱导表达YFP-NtAtg8的烟草BY-2细胞中的自噬体(为便于观察,以绿色显示)(诱导)。箭头表示自噬体,可以被视为一个明亮的绿点。在正常培养基中生长的细胞中没有发现这种结构(对照组)。棒材,10μm。N、 细胞核;五、 液泡。(B) 在无氮源培养24小时的烟草BY-2细胞中自噬体的超微结构。棒材,200μm。AP,自噬体;P、 质体;CW,细胞壁。这张图片由Kiminori Toyooka博士(RIKEN植物科学中心)提供。
图8
图8
显示植物和真菌自噬体形成的示意图。相对于自噬体而言,植物和真菌的液泡尺寸较大,允许在液泡腔内释放单膜自噬小体。在缺乏液泡水解酶活性的细胞中,或者在存在阻断水解酶活性的抑制剂的情况下,完整的自噬体积聚在液泡腔内,可以通过光学显微镜检测到。大多数高等真核生物的溶酶体太小,无法释放自噬体。
图9
图9
串联荧光LC3(tfLC3,mRFP-GFP-LC3)的GFP和mRFP信号显示不同的定位模式。HeLa细胞与表达tfLC3或LAMP-1-CFP的质粒共转染。转染后24小时,细胞在Hanks溶液中饥饿2小时,固定并进行显微镜分析。下部面板是上部面板的较高放大倍数。棒材,上面板10μm,下面板2μm。下部面板中的箭头指向(或标记位置)mRFP和LAMP-1共定位信号的典型示例。箭头指向GFP和mRFP信号的共定域粒子的典型示例(或标记其位置)。该图之前曾作为参考出版,经Landes Bioscience许可复制,版权2007。
图10
图10
LysoTracker Red可对溶酶体进行染色,并可用于监测黑腹果蝇.来自黑腹果蝇用LysoTracker Red(红色)和Höechst 33342(蓝色)染色以染色细胞核。从喂食(左)或饥饿3小时(右)的动物身上分离出组织。棒材,25μm。该图根据参考文献Dev Cell,7,Scott RC,Schuldiner O,Neufeld TP,《饥饿诱导自噬在果蝇属脂肪体,第167–78页,版权所有2004,经爱思唯尔许可。

中的注释

  • 融入潮流。
    克林斯基DJ。 克林斯基DJ。 自噬。2008年2月;4(2):139-40. doi:10.4161/auto.5475。Epub 2007年12月28日。 自噬。2008 PMID:18188002 没有可用的摘要。

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