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.2008年5月；105(3):1048-56.
doi:10.1111/j.1471-4159.2008.05217.x。 Epub 2008年1月7日。

自噬在分化SH-SY5Y细胞G2019S-LRRK2-相关轴突缩短中的作用

爱德华·D·普洛维 1, Salvatore J Cherra第三, 刘永健, 查琳·T·楚
附属公司

自噬在分化SH-SY5Y细胞G2019S-LRRK2-相关轴突缩短中的作用

爱德华·D·普洛维等。 神经化学杂志. 2008年5月.

摘要

神经炎性回缩是与富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）突变相关的退行性表型的一个显著特征，与常染色体显性遗传和一些散发性帕金森病病例有关。帕金森氏病患者的自噬改变，即细胞质成分的空泡分解代谢。在本研究中，我们利用维甲酸分化的SH-SY5Y细胞来确定自噬是否有助于突变体LRRK2相关的轴突变性。将含有常见G2019S突变的LRRK2 cDNA转染预分化SH-SY5Y细胞后，突起长度显著缩短，而野生型LRRK1或其激酶缺失K1906M突变转染的细胞则未见此现象。G2019S LRRK2转染细胞在神经炎和体细胞隔室中的自噬空泡也显著增加，自噬标记物绿色荧光蛋白标记的微管相关蛋白轻链3的荧光和western blot分析以及透射电镜证明了这一点。RNA干扰敲低保守自噬机制的两个重要组成部分LC3或Atg7，逆转了G2019S LRRK2表达对神经元过程长度的影响，而雷帕霉素增强了这些影响。丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶（MAPK/ERK）激酶（MEK）抑制剂1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯硫基]丁二烯（U0126）减少了LRRK2-诱导的神经炎自噬和轴突缩短，这与MAPK/ERG-相关信号传导有关。这些结果表明，自噬在LRRK2致病性突变诱导的轴突重塑中起着积极作用。

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数字

图1
图1
G2019S-富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）-血凝素（HA）cDNA的表达与分化的SH-SY5Y细胞中钝性神经炎突起有关。（a） 绿色荧光蛋白（GFP）荧光和HA-tag免疫荧光分析表明，EGFP-C1载体和G2019S-LRRK2-HA在分化的SH-SY5Y细胞中的共转染导致了弥漫的细胞溶质表达。合并后的图像显示有效的联合转染；细胞核要么与两种质粒的表达相关，要么与两个质粒都不相关。注意，在这些条件下不存在EGFP和LRRK2骨料或颗粒。（b） Western blot显示HA标记野生型和突变LRRK2蛋白（280 kDa）在SH-SY5Y培养物中的表达。（c） 代表合并EGFP（绿色）和LRRK2-HA（红色）叠加照片，显示G2019S-LRRK2表达的钝性神经炎突起。（d） 定量数据显示神经突起缩短，但（1）G2019S-LRRK2转染细胞的细胞体尺寸保持不变*第页与病媒控制相比，<0.05。
图2
图2
G2019S-富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的表达与体细胞和神经炎室中自噬空泡（AVs）增加有关。（a） 与绿色增强荧光蛋白标记的微管相关蛋白轻链3（GFP-LC3）和LRRK2 cDNA或载体对照共转染的分化SH-SY5Y细胞体（上排）和轴突（下排）中LC3点和环的代表性照片。定量图像分析表明，AV数量和AV在体细胞（b，c）和神经炎（d，e）隔室中所占细胞质面积百分比均增加*第页与病媒控制相比，<0.05。
图3
图3
透射电镜照片显示，转染G2019S-富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的分化SH-SY5Y细胞中自噬空泡（AVs）增加。与载体转染（a和c）相比，用G2019S-LRRK2（b和d）转染的培养物在体细胞（a，b）和神经炎（c，d）区室中的早期（箭头）和晚期AV（箭头）均增加。早期AV多见于神经突，而晚期AV主要积聚于胞体。
图4
图4
抑制核心自噬机制可防止与G2019S-富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）相关的神经突起钝化。（a） 典型照片显示，与载体转染细胞和经历轻链3（LC3）或Atg7 RNA干扰（RNAi）敲低的G2019S-LRRK2转染细胞相比，G2019S转染细胞的神经炎突起更短。（b） 定量数据表明，LC3 RNAi对G2019S-LRRK2相关的轴突缩短具有保护作用。黑色条表示用对照小干扰RNA（siRNA）预处理的培养物，灰色条表示用LC3的siRNA预处理的培育物。（c） 定量数据表明，Atg7 RNAi可阻止G2019S-LRRK2相关的轴突缩短。黑色条表示用对照siRNA预处理的培养物，灰色条表示用靶向Atg7的siRNA预治疗的培养物。插图，（b）和（c）：分别显示LC3和Atg7敲除的western blot。（d） 绿色荧光蛋白标记微管相关蛋白轻链3（GFP-LC3）颗粒的分析证实，Atg7 RNAi有效抑制G2019S-LRRK2介导的神经炎自噬空泡（AV）含量的增加。黑色条表示用对照siRNA预处理的培养物，灰色条表示用靶向Atg7的siRNA预治疗的培养物。插图（d）：western blot显示GFP-LC3迁移率改变。2019S-LRRK2表达细胞与载体转染细胞（左车道）相比，脂质化GFP-LC3-II增加。LC3脂质化所必需的Atg7的RNA干扰敲低阻断了2019S-LRRK2共表达细胞中GFP-LC3-I向GFP-LC3-II的转化。（e） 经荧光标记siRNA（红色）预处理后，与pmaxGFP（绿色）和2019S-LRRK2共同转染的分化SH-SY5Y细胞的代表图。超过90%的所有细胞，包括GFP/2019S-LRRK2共转染细胞的93-96%，显示出细胞质siRNA*第页与病媒控制相比<0.05**第页与对照siRNA相比<0.05。
图5
图5
G2019S-富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）诱导的神经炎自噬和轴突缩短在雷帕霉素治疗中增强，在U0126治疗中减弱。（a） 定量数据显示，2μM雷帕霉素增加了Vector和2019S-LRRK2表达细胞中的神经炎自噬空泡（AVs）（左侧图），但仅加剧了2019S-LRRK1表达细胞中神经炎缩短（右侧图）。（b） 3-甲基腺嘌呤（3-MA，5 mM）不能减少2019S-LRRK2诱导的轴突自噬（左侧）或轴突缩短（右侧）。（c） U0126（10μM）减弱2019S-LRRK2诱导的RA-分化SH-SY5Y细胞中轴突AVs增加（左侧），并降低2019S-LRRK_2诱导的轴突缩短（右侧）的程度。插图（c）：与载体转染和激酶死亡的LRRK2表达细胞相比，表达2019S-LRRK_2的未分化SH-SY5Y细胞中细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化增加*第页ANOVA小于0.05，然后是t吨-使用Bonferroni校正进行测试。
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参考文献

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