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.2008年1月；48(1):98-106.
doi:10.1016/j.jhep.2007.07.032。 Epub 2007年10月18日。

声波刺猬是肌纤维母细胞肝星状细胞的自分泌活性因子

刘洋 1, 王颖（音）, 华茂, 苏珊·弗莱格, 阿莱西亚·奥梅内蒂, 凯文·布朗, 杰森·希克里克, 尹晓丽, 安娜·梅·迪尔
附属公司

声波刺猬是肌纤维母细胞肝星状细胞的自分泌活性因子

刘洋等。 肝脏病学杂志. 2008年1月.

摘要

背景/目的：肝损伤期间释放的因子，如血小板衍生生长因子-BB（PDGF），促进肌纤维母细胞肝星状细胞（MFB）的积聚，从而驱动肝硬化的发病机制。刺猬（Hh）通路调节其他受损组织的重塑。本研究评估了声波刺猬（Shh）自分泌促进MFB生长的假说。

方法：原代大鼠肝星状细胞（HSC）在不使用或使用PDGF、PDGF调节激酶的药物抑制剂、表达活化或显性阴性AKT的腺病毒或Hh信号抑制剂的情况下进行治疗。对Shh生成、Hh抑制剂和靶基因的表达以及HSC生长进行评估。

结果：HSC表达Shh、Hh途径成分和Hh抑制剂Hip。在培养期间，Hip表达下降，Shh生成增加，Hh靶基因表达被诱导。中和Shh抗体促进细胞凋亡。添加PDGF增加Shh表达和MFB生长。这两个过程都是在AKT激活后进行的，并被AKT抑制剂废除。腺病毒传递活化的AKT上调Shh表达，表明AKT在调节Shh表达中具有直接作用。Shh中和抗体和其他Hh途径抑制剂阻断PDGF的有丝分裂作用。

结论：这些结果确定Shh是MFB的自分泌生长因子，并提示Hh信号在肝硬化发病机制中的作用。

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数字

图1
图1。培养诱导激活期间大鼠HSC中Shh蛋白表达增加
（A） 分离星状细胞并置于培养基中。免疫印迹法检测Shh和平滑肌α-actin；在同一膜中检测β-actin，以控制蛋白质负荷。该免疫印迹是其他3个独立实验的代表。（B） 分离7天后，用抗Shh抗体和Cy-3结合二级抗体对培养活化的HSC进行染色。在分析其他三种单独的HSC制剂时获得了相同的结果。（C） 在接下来的每一天（0、7和10），从3个培养皿中收集培养基，然后将其添加到转染Gil-Luciferase报告基因构建物的NIH 3T3细胞中。通过萤光素酶测定法测定Shh活性。结果是三次分析的平均值（SE）（*p<0.05 vs第0天（对照））。
图2
图2。HSC表达Hh途径成分，在培养过程中增加Hh靶基因的表达，并利用Shh作为生存因子
分离星状细胞并置于培养基中。从新鲜培养的细胞（第0天）和第4天培养物中获得RNA。如方法所述，通过QRT-PCR评估Hh受体（Patched）（A）、共受体（Smoothed）（B）、靶基因（Gli2）（C）和抑制剂（Hip）（D）的表达。（E） 在含有10%FBS的生长培养基中以5000个细胞/孔的密度重新培养活化的HSC（培养7天）。24小时后，将培养基改为0.2%FBS，并用抗Shh中和抗体或对照IgG处理细胞48小时。测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性。（与对照组相比，p<0.05，n=3个实验），
图3
图3。PDGF诱导培养活化大鼠HSC中Shh表达
（A） 将7天培养激活的HSC进行血清饥饿24小时，然后用20ng/ml PDGF-BB处理0、1、2、3、6和9小时。在每个时间点分离总RNA，并通过实时PCR评估Shh mRNA水平。（B） ●●●●。将培养激活的HSC平行培养物进行血清饥饿24小时，然后用20ng/ml PDGF-BB处理16小时。采集总细胞蛋白，并使用抗Shh（上面板）或β-actin（下面板）进行Western blot分析*与对照组相比p<0.05，n=3个实验
图4
图4。PDGF诱导活化HSC中Shh表达涉及AKT依赖性机制
（A） 对7天培养激活的HSC进行血清饥饿24小时，然后向细胞中添加20ng/ml PDGF-BB，持续0、5、10、30、60和120分钟。收集总细胞蛋白，并使用抗磷酸-Thr308 Akt（上面板）、抗磷酸-Ser473 Akt多克隆抗体。（B） 在24小时血清饥饿后，用25uM ly294002处理7天培养激活的HSC 30分钟，然后用20ng/ml PDGF-BB再处理16小时。免疫印迹法检测Shh；β-actin在与负荷对照相同的膜中检测到。（C） 同时，用Ad5GFP或Ad5dnAkt转导培养激活的HSC；24小时后，用载体（对照）或20ng/ml PDGF处理细胞16小时。收集总细胞蛋白，并使用抗Shh抗体进行Western blot分析。β-肌动蛋白的western印迹证实了等负荷。（D） 用Ad5GFP或Ad5myrAkt转导培养活化的HSC；24小时后，将培养基切换至含有0.2%FBS的DMEM培养48小时。收集总细胞蛋白，并使用抗Shh抗体进行Western blot分析。β-actin作为负荷对照。所有结果（A-D）都代表了3个独立实验的结果。（*与单独的PDGF（B、C）或ad5GF相比，p＜0.05）（D）。
图5
图5。Shh途径介导PDGF对HSC生长的影响
（A） 在含有10%FBS的生长培养基中以5000个细胞/孔的密度重新培养活化的HSC（培养7天）。24小时后，将培养基改为0.2%FBS 24小时，并用载体、环胺、LY294002或AY9944预处理细胞30分钟。然后添加PDGF-BB，将细胞在含有人PDGF-BB（20 ng/ml）的培养基中培养48 h，最后24 h内存在BrdU。通过BrdU掺入评估DNA合成。（B） ●●●●。重复（A）中所述的实验，但用载体、非免疫IgG或抗Shh中和抗体预处理细胞除外。所有数据代表3个独立的实验#与相应对照组相比，p<0.05*与未使用抑制剂的PDGF治疗的培养物相比，p<0.05
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