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.2007年9月21日；130(6):1120-33.
doi:10.1016/j.cell.2007.07.019。

果蝇和哺乳动物通用尺寸控制机制的阐明

Jixin Dong公司 1, 乔治·费尔德曼, 黄建斌, 吴世安（Shian Wu）, Nailing Zhang（张乃玲）, 莎拉·科默福德, 玛丽安娜·盖耶德, 罗伯特·安德斯, 阿尼尔班·迈特拉, 多加·潘
附属公司

果蝇和哺乳动物普遍尺寸控制机制的阐明

Jixin Dong公司等。 单元格. .

摘要

细胞增殖和细胞死亡的协调对于在发育过程中获得适当的器官大小以及在出生后的整个生命周期中保持组织内稳态至关重要。在果蝇中，这两个过程由河马激酶级联调控，河马激酶是一种生长抑制途径，最终拮抗转录辅激活子Yokie（Yki）。在这里，我们证明了Yki中的单个磷酸化位点介导Hippo通路的生长抑制输出。Hippo介导的磷酸化通过将Yki排除在细胞核之外使其失活，而Hippo信号的丢失导致细胞核积聚，从而增加Yki活性。我们进一步描述了哺乳动物Hippo信号通路，该通路最终导致YAP磷酸化，YAP是Yki的哺乳动物同源物。使用条件YAP转基因小鼠模型，我们证明哺乳动物Hippo通路是器官大小的一个有效调节器，其失调导致肿瘤发生。这些结果揭示了后生动物普遍的尺寸控制机制。

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数字

图1
图1。Hippo信号磷酸化Yki S168并促进其细胞质定位
（A） 用α-HA抗体对表达HA-Yki（左）或HA-Yki+Hpo、Sav和Wts质粒（右）的S2细胞进行染色。在100%单独表达HA-Yki的细胞中检测到核HA-Yki-信号，但在Hpo-Sav-Wts共存的细胞中仅9%检测到核HA-Yki信号。（B） 如（A）所示转染细胞并进行亚细胞分离分析。注意主动河马信号下的核Yki减少（比较通道2和通道4）。dSREBP（核）和微管蛋白（胞质）被用作分馏的质量控制。C、 细胞质；N、 核能。（C） 如（A）所示转染细胞，用α-14-3-3（顶部凝胶）探测α-HA免疫沉淀物。用所示抗体（中间和底部凝胶）检测细胞裂解物。Yki，但不是YkiS168A型，在主动Hippo信号下免疫沉淀14-3-3。（D） 如（A）所示转染细胞，用α-P-Yki（S168）和α-HA抗体（顶部两个凝胶）探测α-HA免疫沉淀物。用所示抗体（底部三个凝胶）探测细胞裂解物。Yki，但不是YkiS168A型显示S168磷酸化，在激活的Hippo信号下进一步增加。还要注意Yki，但不是YkiS168A型，显示了主动河马信号下的流动性变化（比较通道2和通道4；分别用白点和黑点表示）。（E） Wts在体外S168磷酸化Yki。V5标记重量（或扭结引线重量杜兰特)在S2细胞中单独或与Hpo-Sav一起表达，免疫沉淀，并与GST-Yki（或GST-Yka）孵育S168A型)用α-P-Yki（S168）对反应产物进行了探讨。还显示了输入激酶和底物（底部的两个凝胶）。请注意，我们的GST-Yki制剂包含两个Yki相关带（Huang等人，2005）。Wts（车道3）时检测到强烈的S168磷酸化，但Wts未检测到杜兰特（车道4），与Hpo-Sav共存。使用GST Yki未检测到S168磷酸化S168A型作为基底（车道5）。（F） Yki的亚细胞分离S168A型突变体。细胞质和细胞核YkiS的相对比例168年在活跃的Hippo信号传导下没有改变。（G） 表达HA-Yki或HA-YkiS2细胞S168A型接受或不接受胰岛素治疗。用指示的抗体（顶部的两个凝胶）探测α-HA免疫沉淀物。用P-S6K或P-Akt抗体（底部两个凝胶）探测细胞裂解物。箭头表示磷化-Akt信号。胰岛素刺激Akt和S6K的磷酸化，但不刺激Yki的磷酸化（比较通道1和2）。（H） 表达HA-Yki或HA-YkiS2细胞S168A型加上组成活性Akt突变体（myr-Akt），如（G）所示进行分析。在存在或不存在myr-Akt的情况下，也可以看到类似的P-Yki（S168）水平（比较车道1和2）。
图2
图2。S168磷酸化介导体内河马信号的生长抑制输出
（A和B）检测Yki（A）和Yki活性的flp-out策略S168A型（B） 体内试验。（C） 成虫携带浴缸>年+>yki公司（左）或浴缸>年+>yki公司S168A型（右）和眼特异性FLP重组酶。这些苍蝇被一起拍照以显示它们的相对大小。注意苍蝇的眼睛放大和折叠（箭头）以及头部多余的角质层（箭头）表示浴缸>yki公司S168A型（右）。（D和E）眼盘浴缸>年+>yki公司（D） 或浴缸>年+>yki公司S168A型（E） 和眼特异性FLP重组酶。这些图像是在相同的放大倍数下拍摄的。（F和G）携带浴缸>年+>yki公司（F） 或浴缸>年+>伊基S168A型（G） 一个热休克诱导的FLP源，一龄幼虫期热休克。为了拍照，翅膀被取下了。注意仅（G）中存在胸部过度生长（箭头）。（H和H′）视盘包含浴缸>年+>yki公司flpout克隆，染色为Yki（红色）和Diap1（绿色）。H中的圆形区域表示一个flpout克隆，它表达了较高水平的Yki。克隆中的Diap1水平不受影响（H′箭头所示）。（I和I′）类似于H和H′，但浴缸>年+>yki公司S168A型对克隆（在[I]中用圆圈圈出）进行了分析。注意克隆中的Diap1水平增加（[I′]中的箭头）。
图3
图3。河马信号的失活导致Yki在体内的核蓄积
在所有面板中，显示了三个图像，其中一个是GFP（面板A、B、C和D）（绿色），另一个是Yki（面板A′、B′、C′和D′）（红色），还有一个是叠加的GFP和Yki（板A〃、B〃、C〃和D〃）。此处使用的GFP标记集中在细胞核中。（A–A〃）三龄翼盘包含yki公司B5公司克隆并用α-Yki.−/−染色克隆以无GFP（白色箭头）标记，而+/+双斑点以2×GFP信号（深绿色，黄色箭头）标记。注意，−/−克隆中没有Yki染色，双斑点中的Yki染色增加，GFP标记的细胞核中相对没有Yki信号。（B–B〃）三龄眼盘。注意GFP标记的细胞核中相对缺乏Yki信号。箭头标记MF。（C–C〃）三龄眼盘包含重量X1型克隆。注意野生型细胞中相对缺乏核Yki。相反，Yki存在于细胞的细胞质和细胞核中重量X1型克隆（箭头）。（D–D〃）三龄翼型，包含高功率放大器42–47克隆。注意野生型细胞中相对缺乏核Yki。相反，Yki存在于细胞的细胞质和细胞核中高性能操作42–47克隆（箭头）。
图4
图4。哺乳动物河马信号通路导致YAP S127磷酸化的描述
（A） 如图所示，用表位标记的构建物转染HEK293细胞。请注意，由Lats1/2（车道2）、Mst1/2（车道4）或两者（车道6）引起的YAP（S127）磷酸化和移动性延迟增加，但不包括各自的激酶死亡形式或其组合（车道3、5和7）。蛋白质带右侧的一个小点表示YAP的缓慢迁移物种。（B） 对表达所示质粒的HEK293细胞进行分析。蛋白质带右侧的一个小点表示YAP的缓慢迁移物种。（C） 对表达所示质粒的ACHN细胞进行分析。请注意，Mst1/2（车道3）而不是Lats1/2（车道5）未能诱导YAP（S127）磷酸化，并且hWW45（车道4）修复了该缺陷。还要注意，hWW45单独（通道2）可以诱导YAP（S127）磷酸化。（D） 用α-P-YAP（S127）和α-YAP对不同细胞系进行检测，并用RT-PCR分析指示基因的表达。注意没有hWW45型ACHN细胞（通道4）中YAP（S127）磷酸化水平显著降低。（E） 稳定表达YAP的HPNE细胞（中间），但不表达空载体（左），在软琼脂中生长形成菌落。稳定表达YAP的HPNE细胞S127A型长成明显较大的菌落（右）。多个独立建立的细胞系也获得了类似的结果。（F） 表达YAP（左）或YAP的成虫头部S127A型（右）眼睛。基因型为：GMRGal4/UASYAP（左）和GMRGal4/UASYAPS127A型（右）。这些头部被一起拍照，以显示它们的相对大小。
图5
图5。YAP条件激活/灭活对哺乳动物器官大小的可逆控制
（A） ApoE/rtTA-YAP小鼠示意图。（B） 在没有或存在Dox的情况下对对照和转基因肝脏中hYAP转基因表达进行RT-PCR分析1周。每种基因型/条件使用两只小鼠。（C和D）来自对照（左）和ApoE/rtTA YAP（右）小鼠的肝脏从3周龄开始在Dox上保持1（C）或4（D）周。（E） YAP诱发肝肿大的时间进程。按照（C）和（D）诱导YAP，并在指定时间测量肝脏和体重。数值代表平均值±SD（n=4；***p<0.001，t检验）。（F和G）对照（F）和转基因（G）肝脏在Dox暴露4周后的苏木精和伊红（H&E）染色。这两张照片都是在相同的放大倍数下拍摄的。注意转基因肝脏中的细胞密度较高。（H和I）通过停药逆转肝脏过度生长。三周龄ApoE/rtTA-YAP小鼠首先在Dox上饲养2（H）或8（I）周，然后从饮用水中取出Dox。数值代表平均值±SD（n=4）。
图6
图6。哺乳动物河马途径对细胞增殖和凋亡的协调调控
（A） Dox暴露2周后，对来自对照（白柱）和ApoE/rtTA-YAP（黑柱）肝脏的选定基因进行实时定量RT-PCR分析。基因表达测量一式三份，用平均值±SEM表示细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白E2不显著（p=0.1，t吨测试）。（B和C）YAP过度表达促进细胞增殖。Dox暴露1周后，对对照组（B）和ApoE/rtTA-YAP（C）肝脏进行BrdU掺入分析（红色），DAPI反染分析（蓝色）。（D–H）YAP过度表达对细胞凋亡具有强大的抵抗力。对照组和ApoE/rtTA-YAP窝鼠在Dox饲养1周，注射Jo-2，并在注射后3小时通过H&E染色（D和E）、TUNEL（F和G）和细胞死亡标记物（H）的western blotting进行分析。注意对照组（D）中广泛出血（星号）和凋亡细胞核（箭头），但转基因肝脏（E）中没有。还应注意对照组（F）的广泛TUNEL染色，但转基因肝脏（G）没有。在（H）中，在对照组中检测到caspase-3（Casp3）和PARP的裂解，但在转基因肝脏中未检测到PARP裂解（箭头标记裂解的PARP产物）。对每种基因型的三只动物进行分析。（一） RNAi击倒比尔5/生存素降低YAP的转化活性。左：西部斑点显示增加BIRC5/survivin公司与模拟转染的细胞相比，YAP-HPNE细胞中的表达，以及BIRC5/survivin公司在稳定表达的YAP-HPNE细胞中的表达比尔5/生存素shRNA。右图：软琼脂试验显示YAP-HPNE细胞的非凤尾鱼依赖性生长，这一特征在模拟转染HPNE的细胞中未观察到。注意，YAP-HPNE细胞稳定表达比尔5/生存素shRNA形成数量减少的菌落。
图7
图7。哺乳动物河马通路的失调导致体内肿瘤发生
（A） ApoE/rtTA-YAP小鼠的肝脏在Dox饲养8周，从出生后3周开始。注意肝内散在的离散结节（箭头）。（B） ApoE/rtTA-YAP小鼠的肝脏在出生时在Dox饲养了3个月。注意肝细胞癌在整个肝脏广泛发展。（C–E）小鼠肝结节的组织病理学检查显示肝细胞癌的特征。如（A）所示，给小鼠喂多克斯水。（C） 显示了YAP诱导的HCC的细胞倍体形态，大细胞（箭头所示）被小细胞包围。（D） 显示细胞质染色丢失（箭头），或所谓的“透明细胞改变”。（E）显示肝板扩张。网织蛋白染色突出显示了肝板的边缘（由平行线表示），HCC中的肝板比非肿瘤性肝脏中典型的1到2个细胞宽。（F） 对照组（Non-Tg）和ApoE/rtTA-YAP（Tg）窝友在Dox饲养时的存活曲线，如图所示，从3周或8周龄开始。（G） 保护性河马激酶级联果蝇属和哺乳动物。相应的蛋白质果蝇属哺乳动物是通过颜色和形状的匹配来表示的。还指出了Yki和YAP上的关键磷酸化位点。“X”表示与Yki或YAP合作调节靶基因转录的未知DNA结合蛋白。
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