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.2007年9月；18(9):3533-44.
doi:10.1091/mbc.e07-03-0249。 Epub 2007年7月5日。

deltaEF1蛋白在TGF-β诱导的上皮-间充质转化中对上皮和间充质标志物的差异调节

白原拓彦 1, Masao Saitoh公司, 宫佐小平
附属公司

deltaEF1蛋白在TGF-β诱导的上皮-间充质转化中对上皮和间充质标志物的差异调节

白原拓彦等。 分子生物学细胞. 2007年9月.

摘要

上皮-间充质转化（EMT）是肿瘤进展和胚胎发育的关键事件，由转化生长因子（TGF）-β在小鼠乳腺NMuMG上皮细胞中诱导。以前有报道称Id蛋白可以抑制TGF-β诱导的EMT的主要特征。在本研究中，我们表明，TGF-β逐渐增加了deltaEF1家族蛋白，即deltaEFl（ZEB1）和SIP1的表达，其表达谱与E-cadherin的表达谱相互作用。SIP1和deltaEF均通过与E-cadtherin启动子直接结合显著下调NMuMG细胞中E-cadherin的转录。沉默SIP1和deltaEF1的表达，但不是单独沉默，完全消除了TGF-β诱导的E-cadherin抑制。然而，包括纤维连接蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白在内的间充质标记物的表达不受SIP1和deltaEF1基因敲除的影响。TGF-β诱导了Ets1的表达，而Ets1又激活了deltaEF1启动子的活性。此外，通过敲低Ets1表达来抑制TGF-β对SIP1和deltaEF1表达的上调。此外，Id2抑制TGF-β和Ets1诱导的δEF1上调。综上所述，这些研究结果表明，deltaEF1家族蛋白SIP1和deltaEF1对于TGF-β诱导的EMT是必要的，但还不够，TGF-贝塔诱导的Ets1可能是SIP1与deltaEFl的上游转录调控因子。

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数字

图1。
图1。
TGF-β在NMuMG细胞中诱导EMT。（A） 不使用（A）或使用1 ng/ml TGF-β（b）处理24小时的细胞的相位对比图像。（B） 在不使用（a–c）或（d–f）1 ng/ml TGF-β治疗24小时后，细胞免疫荧光图像显示所示标记物的定位和组织。显示了通过TRITC-类球蛋白染色（a和d）、E-钙粘蛋白染色（b和E）和N-钙粘素染色（c和f）确定的肌动蛋白细胞骨架的重组。（C） 在使用或不使用1 ng/ml TGF-β治疗24 h后，通过免疫印迹法检测E-钙粘蛋白、纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白的内源性水平。α-微管蛋白水平作为全细胞提取物的负荷控制进行监测。（D和E）通过半定量RT-PCR分析，在TGF-β处理的细胞中检测目标基因的诱导，包括E-cadherin、SIP1、δEF1、Id2（D）和蜗牛（E）。显示了TGF-β处理的细胞与未处理的细胞中mRNA水平的比值。数值标准化为家政GAPDH mRNA的数量。
图2。
图2。
外源性SIP1或δEF1下调E-cadherin表达。（A） NMuMG细胞（左）与小鼠E-cadherin启动子报告结构（E-cadherin-Luc.）联合0.5μg ALK5TD或0.7μg E47-、SIP1-、δEF1-、蜗牛-、Slug-和扭曲表达质粒共转染。MDCK细胞（右）与E-cadherin-Luc和0.7μg E47-、SIP1-和蜗牛表达质粒共同转染。转染后24小时，收集细胞并检测荧光素酶活性。（B） NMuMG细胞与E-cadherin启动子报告质粒和野生型SIP1（WT）或SIP1-ΔSBD（ΔSBD）瞬时共转染。检测A。（C）感染模拟、Flag-SIP1和Flag-δEF1腺病毒的NMuMG细胞的荧光素酶活性，用抗Flag M2（左二）和抗E-cadherin抗体（右二）进行免疫染色，并用TOTO3染色检测细胞核（右侧）。（D） 通过定量RT-PCR测定感染模拟、SIP1或δEF1腺病毒的NMuMG细胞中E-cadherin mRNA的表达水平。将数值归一化为GAPDH mRNA。
图3。
图3。
小鼠E-cadherin启动子中的E-box1和E-box2是E-cadherinSIP1和δEF1依赖性抑制所必需的。（A）荧光素酶分析中使用的小鼠野生型E-cadhern-luciferase构建物（WT）及其突变体的示意图。将浓度为0、0.1、0.25和0.5μg的（B和C）SIP1或δEF1表达质粒与小鼠野生型E-cadherin荧光素酶构建物（WT）及其突变体在NMuMG细胞中共同转染。转染后24小时，荧光素酶活性测定如材料和方法。（D） 用与小鼠E-cadherin基因（E-box2/1 WT）或其突变体（mut.）的E-box2/1相似的探针进行凝胶位移分析。过度表达Flag-SIP1的NMuMG细胞的核提取物与所示探针孵育。与E-box2/1结合的SIP1与50倍摩尔过剩的未标记野生型或突变探针竞争。黑色箭头表示SIP1复合体的位置。在结合反应中加入抗Flag M2抗体后，观察到超移位复合物（白色箭头）。
图4。
图4。
SIP1和δEF1的双重敲除减轻TGF-β诱导的E-钙粘蛋白调节。（A） 用1.0 ng/ml TGF-β刺激转染SIP1 siRNA、δEF1 siRNA或两种siRNA（SIP1+δEF1）的NMuMG细胞24小时，并通过半定量RT-PCR分析检测SIP1（左）、δEFl（中）和E-cadherin水平（右）。将数值归一化为GAPDH mRNA的数量。（B）未转染或带有对照（NC）或同时转染SIP1和δEF1（SIP1+δEF1）siRNAs的NMuMG细胞用1.0 ng/ml TGF-β刺激24 h，并进行E-cadherin的免疫荧光染色。（C）通过伤口试验（左）测定敲除细胞在无或存在TGF-β的情况下的迁移行为，并按照材料和方法（右）。NC，对照siRNA。
图5。
图5。
SIP1和δEF1击倒细胞中间充质标志物的变化。（A） 用2.5 ng/ml TGF-β刺激转染SIP1和δEF1（SIP1+δEF1）siRNAs的NMuMG细胞24小时，并通过半定量RT-PCR分析检测E-钙粘蛋白（左）、纤维连接蛋白（中）和N-cadherin（右）的水平。将数值标准化为GAPDH mRNA的量。（B）用对照（NC）或SIP1和δEF1（SIP1+δEF1）siRNA转染的NMuMG细胞用TGF-β刺激24小时，并使用抗δEF1、E-钙粘蛋白、纤连蛋白和N-钙粘蛋白抗体进行免疫印迹分析。α-微管蛋白水平作为全细胞提取物的负荷控制进行监测。（C） 在不含或含有对照（NC）或SIP1和δEF1（SIP1+δEF1）siRNAs的情况下转染细胞后，细胞在没有或存在1 ng/ml TGF-β的情况下生长，然后使用TRICT-球蛋白直接染色肌动蛋白细胞骨架。NC，控制siRNA。
图6。
图6。
TGF-β诱导SIP1的从头蛋白质合成要求。用5μM环己酰亚胺（CHX）预处理1 h的NMuMG细胞用1 ng/ml TGF-β刺激12 h。提取RNA并用半定量RT-PCR分析，以确定内源性Smad7、蜗牛和SIP1的水平。将数值标准化为GAPDH mRNA的数量。
图7。
图7。
Ets1参与TGF-β诱导的δEF1家族基因表达。（A） 从用1 ng/ml TGF-β处理的NMuMG细胞中提取RNA，并通过半定量RT-PCR分析Ets mRNA的表达。显示了TGF-β处理细胞与未处理细胞中Ets1 mRNA水平的比值。将数值归一化为GAPDH mRNA的量。（B）细胞与小鼠E-cadherin启动子荧光素酶质粒（E-cadherin-Luc）和0.1或0.3μg Ets1质粒共转染，培养24 h，并测量荧光素酶活性。（C） 细胞与δEF1启动子-荧光素酶质粒（δEF1-Luc）共转染，将指示的质粒孵育24 h，并测量荧光素酶活性。Id2表达质粒在0.1μg（+）和0.5μg（++）浓度下使用。（D） 用抗小鼠Ets1的siRNA转染的细胞孵育8 h，用1 ng/ml TGF-β再处理24 h，然后用半定量RT-PCR分析以确定内源性Ets1（左）、SIP1（中）和δEF1（右）的水平。将数值标准化为管家β-葡萄糖醛酸酶mRNA的数量。NC，对照siRNA。用1 ng/ml TGF-β刺激感染pBabe或pBabe-Id2的NMuMG细胞。12 h后，通过半定量RT-PCR测定Id2和内源性δEF1水平。将数值标准化为β-葡萄糖醛酸酶mRNA的数量。
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