ATG1, an autophagy regulator, inhibits cell growth by negatively regulating S6 kinase

doi:10.1038/sj.embor.7400917

.2007年4月；8(4):360-5.

doi:10.1038/sj.embor.7400917。 Epub 2007年3月9日。

自噬调节因子ATG1通过负调节S6激酶抑制细胞生长

宋百利¹, Sunhong Kim先生, 李继勋（Jiwoon Lee）, Jeehye公园, 李千娜, 金永成（Yongsung Kim）, 金曼·金, Jongkyeong Chung先生

附属公司

PMID： 17347671
预防性维修识别码：第1852764页
内政部： 10.1038/sj.embor.7400917

ATG1是一种自噬调节器，通过负调控S6激酶抑制细胞生长

宋百利等。 EMBO代表. 2007年4月.

.2007年4月；8(4):360-5.

doi:10.1038/sj.embor.740917。 Epub 2007年3月9日。

作者

宋百利¹, Sunhong Kim先生, 李继勋（Jiwoon Lee）, Jeehye公园, 李千娜, 金永成（Yongsung Kim）, 金曼·金, Jongkyeong Chung先生

附属

¹韩国高级科学技术研究院生物科学系国家细胞生长调控创新研究计划中心，韩国大田市玉松谷库松洞373-1号，邮编305-701。

PMID： 17347671
预防性维修识别码：项目经理1852764
内政部： 10.1038/sj.embor.7400917

摘要

有人提出细胞生长和自噬是根据细胞营养状态进行协调的，但它们之间的关系尚未完全理解。在这里，我们对自噬调节激酶Autophagy-specific基因1（ATG1）的苍蝇突变体进行了特征分析，发现ATG1是雷帕霉素（TOR）/S6激酶（S6K）通路靶点的负调控因子。我们的果蝇研究表明，ATG1通过干扰S6K激活抑制TOR/S6K依赖性细胞的生长和发育。一贯地，哺乳动物细胞中ATG1的过度表达也以激酶活性依赖的方式显著抑制S6K，并且短干扰RNA介导的ATG1敲低诱导S6K和S6磷酸化的异位激活。此外，我们证明ATG1通过阻断Thr 389处S6K的磷酸化来特异性抑制S6K活性。综上所述，我们的遗传和生化结果强烈表明自噬和细胞生长调节之间存在串扰。

PubMed免责声明

数字

图1
参与*果蝇自噬特异基因1*在里面*雷帕霉素的果蝇靶标*-依赖性细胞生长发育。(A类)CG10967的基因组结构。EP3348的P元件插入位点(*DmATG1型*¹)表示。(B类)*DmATG1型*用qRT-PCR对3龄幼虫进行了分析。核糖体蛋白49(*转速49*)用作内部控制；n个=3.条形图表示平均值±标准差(C类)产蛋（AEL）后第3天（顶部）和第6天（中部）指定基因型的幼虫图像，以及每个基因型发育到三龄中后期的幼虫数量（底部）；n个=3.横线表示平均值±标准差。在每次实验中，每个基因型的15只幼虫被检测。(天)抑制脂肪体中脂质小泡聚集*数据任务大纲*基因剂量减少的突变体*DmATG1型*在全喂条件下，所示基因型的二龄/三龄早期幼虫的脂肪体图像。(E类)所示基因型的幼虫唾液腺图像。分别用Hoechst33342（伪绿色）和指骨苷-TRITC（红色）可视化幼虫唾液腺细胞的细胞核和细胞边界。(F类)图1E中细胞和细胞核大小的定量分析；n个=5.条形图表示平均值±标准差。*DmATG1型*,*果蝇自噬特异基因1*;*数据任务大纲*,*果蝇TOR*; qRT-PCR，定量实时逆转录酶-PCR。

图2
之间的功能交互*果蝇自噬特异基因1*和*果蝇属*S6激酶。(A类)羽化后成虫存活数量的指定基因型；n个=3.横线表示平均值±标准差。在每次实验中，每个基因型的15只幼虫被检测。(B类,C类)激活dS6KDmATG1型突变体。使用磷酸特异性dS6K T398抗体在指定基因型的三龄幼虫或蛹中通过免疫印迹分析检测dS6K的磷酸化。采用Tubulin免疫印迹作为负荷对照。表达Rheb的苍蝇(*hs>Rheb*)用作阳性对照(C类).小时>*Rheb公司*在样品制备之前，幼虫在37°C下受到热休克1小时，然后在30°C下孵育3小时，以诱导Rheb表达。为了定量，使用Adobe Photoshop测量每个基因型中dS6K磷酸化的水平，并将其标准化为微管蛋白水平。结果表示为与野生型对照组相比的折叠变化(*w1118型*).DmATG1型,*果蝇自噬特异基因1*; dS6k，*果蝇属*S6激酶。

图3
自噬特异基因1抑制S6激酶磷酸化。(A类,B类)转染标记质粒的HEK 293T细胞(A类)剥夺营养90分钟，然后补充DMEM 30分钟或(B类)用50 ng/ml表皮生长因子（EGF）刺激30分钟。使用适当的抗体通过免疫印迹分析S6K免疫复合物（前三个面板）。标记（ATG1α）杂交从相同的细胞裂解物中完成（底部面板）。(C类)将转染对照siRNA、ATG1αsiRNA或ATG1βsiRNA的HEK 293T细胞剥夺营养90 min，然后测定内源性S6K（顶部两个面板）和S6（底部两个面板。(天)转染对照siRNA或ATG1αsiRNA的HEK 293T细胞被剥夺营养90分钟，然后补充DMEM 30分钟。检测内源性S6K的磷酸化和蛋白质水平。为了量化，使用Adobe Photoshop测量S6K Thr 389磷酸化水平，并将其归一化为S6K蛋白水平。结果表示为与第一个指示样品相比的折叠变化。(E类)用对照siRNA或ATG1αsiRNA转染HEK293T细胞，转染pEGFP-C1（一种转染标记物，绿色），营养液涂抹90分钟，固定并用磷酸特异性S6抗体（红色）染色。ATG1，自噬特异性基因1；HA，血凝素；KI，ATG1αLys 46 Ile（激酶死亡）突变体；siRNA，短干扰RNA；S6K、S6激酶；WT，野生型。

图4
自噬特异性基因1α抑制S6激酶Thr 389磷酸化。(A类,B类)用HA–Akt转染HEK 293T细胞(A类)或Myc–RSK(B类)和/或Flag–ATG1αWT或KI质粒。使用适当的抗体（前三个面板）通过免疫印迹分析免疫沉淀Akt和RSK蛋白。标记（ATG1α）杂交从相同的细胞裂解物中完成（底部面板）。(C类)用HA–S6K Thr 389-Glu突变体和/或Flag–ATG1αWT或KI转染HEK 293T细胞。使用抗磷酸特异性S6K Thr 229（上图）和HA（S6K）抗体（中间图）通过免疫印迹分析免疫沉淀的S6K突变体。Flag（ATG1α）杂交从相同的细胞裂解物中完成（底部面板）。ATG1，自噬特异性基因1；表皮生长因子；HA、血凝素；KI，ATG1αLys 46 Ile（激酶死亡）突变体；核糖体S6激酶；WT，野生型。

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