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.2007年4月1日；403(1):13-20.
doi:10.1042/BJ20061881。

与Ste20相关的MAP4激酶是mTOR信号的营养敏感调节器

格雷格·M·芬德利 1, 李俊燕, 朱莉娅·普罗克特, 弗吉尼亚·米尤莱, 理查德·兰姆
附属公司

与Ste20相关的MAP4激酶是mTOR信号的营养敏感调节器

格雷格·芬德利等。 生物化学杂志. .

摘要

mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）信号通路是细胞生长的关键调节器，受生长因子和氨基酸等营养物质的控制。虽然生长因子受体到mTOR的信号通路已被阐明，但营养物质介导信号通路的特征尚不明确。通过对果蝇mTOR信号通路中活性蛋白激酶的筛选，我们确定了一个Ste20家族成员（MAP4K3），该成员是S6K（S6激酶）/4E-BP1[eIF4E（真核起始因子4E）结合蛋白1]磷酸化最大化所必需的，并调节细胞生长。重要的是，MAP4K3活性受氨基酸调节，但不受生长因子胰岛素调节，也不受mTORC1抑制剂雷帕霉素调节。因此，我们的结果表明，营养素通过激活MAP4K3向mTORC1发出信号。

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数字

图1
图1。MAP4K3作为mTOR信号传导至S6K的激活剂的鉴定
(A类)dTsc1与果蝇属激酶通过dsRNA添加到S2细胞。上面板，dS6K免疫印迹；下面板，添加dsRNA后的dTsc1免疫印迹。与对照未经处理的细胞（UN）相比，dTsc1的耗尽导致dS6K（箭头）超磷酸化物种的丰度增加，而对照未经治疗的细胞通过50 nM雷帕霉素处理1 h（Rapa）或dTOR的共同耗尽而逆转，CG1776号,CG7097号或CG8767号用ImageQuant软件定量放射自显影后，免疫印迹上方显示了高磷酸化dS6K（上面板）和低磷酸化dS6K（下面板）的比率。NS表示用dTsc1抗体检测到的非特异性条带。预测的BLAST同源性果蝇属蛋白质表明CG1776号,CG7097号和CG8767号分别为：肌球蛋白轻链激酶（E值3e-77）、MAP4K3（E值4e-131）和c-Mos（E值1e-18）。(B类)S6K1 Thr的抑制389通过HeLa细胞中MAP4K3的RNAi。将HeLa细胞转染到含有10 mM葡萄糖和10%FCS的DMEM中，其中含有对照siRNA、Rheb siRNA和两种不同的靶向MAP4K3的siRNA双工体（M4K3-1和M4K3-2）。72小时后，细胞被血清饥饿1小时，并通过免疫印迹分析裂解产物。第1组，S6K1在Thr的磷酸化389用磷酸特异性抗体检测；第2组，用抗S6K1总蛋白的单克隆抗体复制第1组；第3组，用多克隆抗MAP4K3抗体检测MAP4K2水平；第4组，用单克隆抗Rheb抗体检测Rheb水平。注：拼接这些面板中的印迹，以去除与MAP4K3 siRNA处理相对应的一条通道，该处理不能有效地抑制MAP4K2的表达。Thr比率389显示了siRNA处理后磷酸化（T389-P）占总S6K的比例，并使用ImageQuant软件从扫描的放射自显影中对其进行了量化，而对照siRNA处理的数值为1。(C类)RNAi耗尽MAP4K3抑制TSC2耗尽诱导的S6磷酸化。将对照siRNA单独或TSC2 siRNA与对照siRNA或靶向Rheb或MAP4K3（M4K3-1）的siRNA以及按照(B类). 上面板，Ser处S6的磷酸化240/244用磷酸特异性抗体检测；中间面板，用S6抗体探测重复凝胶；下面板，用多克隆抗TSC2抗体检测TSC2。Ser的比率240/244显示了siRNA处理后的磷酸化（S240/44-P）总S6，并使用ImageQuant软件从扫描放射自显影图中定量。(D类)MAP4K3的耗竭抑制S6K1 Thr389氨基酸再刺激诱导的磷酸化。HeLa细胞被转染，血清饥饿1小时，如(B类). 对于氨基酸耗竭/再刺激，将转染有对照siRNA、Rheb siRNA或MAP4K3 siRNA的重复孔转移到含有10 mM葡萄糖和1×MEM的DPBS中30分钟或相同的处理，然后转移到无血清DMEM中30分钟（+AA）。第1组，S6K1在Thr的磷酸化389（箭头）用磷酸特异性抗体检测；第2组，用S6K1总抗体探测的重复凝胶；面板3，Ser处S6的磷酸化240/244用磷酸特异性抗体检测；第4组，用抗S6总抗体探针的重复凝胶；第5组，用多克隆抗MAP4K3抗体检测MAP4K2水平；第6组，用单克隆抗Rheb抗体检测Rheb水平。
图2
图2。MAP4K3激活发送至S6K和4E-BP1的mTOR信号
(A类)MAP4K3的过表达激活S6的磷酸化，并依赖于激酶活性。HEK-293T细胞转染2.5μg pRK5myc载体或pRK5m yc MAP4K3野生型或AFG激酶缺失MAP4K3.（KD）。24小时后，将细胞无血清培养16小时，对照组用10%FCS刺激30分钟（FCS 30′），或在刺激前用100 nM沃特曼预处理60分钟（FCS 30'+麦芽汁），并制备裂解液。第1组，用抗Ser的磷酸特异性抗体检测内源性S6K磷酸化235/236; 第2组，使用针对Ser的磷酸化特异性抗体检测S6磷酸化240/244; 面板3，总计S6；第4组，检测Myc-epitope标记激酶表达的抗Myc（9E10）抗体。(B类)MAP4K3的过度表达不会激活Ser473PKB磷酸化。HEK-293T细胞被转染为(A类)用pRK5myc载体、pRK5mycMAP4K3、pRK5mycMsn或pCI HA TNIK和裂解产物用抗体进行检测，如(A类)，或带有PKB Ser抗体473（第1组）、总PKB（第2组）或HA表位检测HA-TNIK（第6组）。作为PKB激活的对照，在刺激前用1μM胰岛素（Ins）刺激载体转染细胞30分钟或用100 nM沃特曼（Wt）预处理60分钟。(C类)MAP4K3激活S6K1对雷帕霉素敏感，但与MEK和PI3K信号无关。用所示质粒转染HEK-293T细胞，如(A类)和(B类)以及0.1μg pRK5 S6K–GST。在裂解之前，用50 nM的雷帕霉素（Rapa）预处理细胞60分钟，或用雷帕霉素处理细胞并用1μM胰岛素（Ins）刺激30分钟。对于wortmannin和PD184352处理，在裂解前用50 nM（泳道9）、100 nM（泳道10）或200 nM（泳道11）wortmannin或1μM（泳道12）或10μM（泳道13）PD184352处理细胞60分钟。面板1，Thr389S6K–GST报告子的磷酸化；第2组，用S6K1单克隆抗体检测S6K–GST报告子；面板3在体外用S6底物测定S6K1–GST活性的激酶分析；面板4和5，使用针对Myc表位（面板4）和HA表位的9E10抗体检测激酶表达（面板5）。S6K活性值通过使用ImageQuant软件对磷光图像进行定量测定。(D类)MAP4K3的过度表达激活4E-BP1的磷酸化。HEK-293T细胞被转染为(A类)含2.5μg pRK5myc载体或pRK5m ycMAP4K3以及1μg pcDNA-3xHA-4E-BP1报告子。100 nM沃特曼（Wt）和50 nM雷帕霉素（Rapa）治疗和胰岛素刺激(C类). 上部面板，Thr处的HA–4E-BP1磷酸化70用磷酸特异性抗体检测；中间面板，用4E-BP1抗体检测HA–4E-BPl水平；下面板，用抗Myc 9E10抗体检测MAP4K3水平。
图3
图3。MAP4K3参与氨基酸信号传导和生长
(A类)异位MAP4K3过度表达延迟了氨基酸戒断诱导的S6K1失活。如图2（A）所示，用2.5μg pRK5myc载体或pRK5myMAP4K3和0.1μg pNK5 S6K-GST报告子转染HEK-293T细胞，并将其血清饥饿16小时。随后用1μM胰岛素刺激载体转染细胞30分钟（Ins，时间0），并在裂解前将其转移至DPBS，如图1（D）所示，持续5–60分钟，或者如果未刺激表达MAP4K3，则将其转移到DPBS，持续5-60分钟（MAP4K2）。面板1，Thr389S6K–GST报告基因磷酸化（箭头）；第2组，用S6K1单克隆抗体检测S6K–GST报告子；面板3在体外用S6底物测定S6K1–GST活性的激酶分析；第4组，使用针对Myc表位的9E10抗体检测MAP4K3表达。(B类)定量[32P] GST-S6如所示(A类)根据一个实验的三次重复分析，重复三次，结果相似。的任意值[32P] 使用磷光成像仪测量GST-S6，并将MAP4K3和胰岛素刺激样品的结果分别表示为各组初始活性的百分比（平均值±S.D.）（在时间0时，氨基酸提取前为100%）。(C类)MAP4K3受氨基酸调节，但不受胰岛素或mTORC1的调节。用0.1μg pRK5myc载体（+AA-Vec）、0.1μg p RK5myMAP4K3 AFG激酶缺失突变体（+AA-KD）或0.1μg的pRK5m yMAP4k3野生型（MAP4K2）转染HEK-293T细胞，并进行血清饥饿16 h。右面板：用1μM胰岛素（+AA+Ins 30′）刺激血清饥饿细胞（+AA）30分钟，或用50 nM雷帕霉素处理30分钟（+AA+Rapa 30′）；左面板：将缺乏血清的细胞转移到DPBS（−AA）中30分钟，制备裂解物，或随后通过转移到缺乏血清的DMEM中5–30分钟（−AA+AA）用氨基酸重新刺激裂解物。图1，放射自显影在体外用MBP底物进行抗Myc免疫沉淀物的激酶测定；第2组，9E10免疫沉淀物中五分之一的MAP4K3水平在体外用多克隆抗MAP4K3抗体检测激酶；面板3，S6K1在Thr的磷酸化389用磷酸特异性抗体检测；第4组，用抗总S6K1的单克隆抗体复制第2组。(D类)定量[32P] MBP如所示(C类)根据一个实验的三次重复分析，重复三次，结果相似。的任意值[32P] 使用荧光成像仪测量MBP，并使用ImageQuant软件进行处理。结果表示为氨基酸（+AA）存在时活性的倍差。定量分析显示，在30分钟氨基酸戒断后MAP4K3活性被抑制了6.3倍，在15分钟氨基酸重新添加到氨基酸分泌细胞后激活了8.8倍。在存在氨基酸的情况下，胰岛素刺激和雷帕霉素治疗均导致MAP4K3活性激活1.3倍。(E类)MAP4K3调节HeLa细胞的细胞大小。将保存在含有10%FCS的DMEM中的HeLa细胞转染对照siRNA，不处理或用50 nM雷帕霉素处理48 h，或转染抗Rheb或MAP4K3的siRNA（M4K3-1或M4K3-2），并在碘化丙啶染色后进行FACS分析。G公司1未经处理的对照siRNA转染细胞（黑色）的前向散射分析显示，细胞上覆盖着雷帕霉素处理的细胞，以及Rheb siRNA或MAP4K3 siRNA-转染的细胞（灰色）。表中G的中值FSC（前向散射）值的差异1-、S和G2/M期细胞（以*标记）在统计学上具有高度显著性z（z）-测试(P（P）<0.001）与对照siRNA载体处理细胞相比。(F类)MAP4K3参与mTOR信号传导的模型。生长因子主要通过激活蛋白激酶（如PKB[3]和/或ERK/Rsk[17,18]）激活mTORC1途径，导致TSC1-2肿瘤抑制因子失活并增加Rheb。GTP水平。反过来，Rheb。GTP被提议激活mTORC1激酶活性，尽管该机制存在不确定性，因为Rheb与mTOR的结合与结合核苷酸无关[20]，不像其他小GTPase/效应器相互作用（用问号表示）。自Rheb。GTP水平对氨基酸提取不敏感[12]，但MAP4K3和S6K活性都是敏感的（本研究和[5]），我们认为MAP4K2可能在氨基酸和S6K1活性之间提供特定的联系。还表明Vps34参与向S6K发送氨基酸信号，由于目前尚不清楚这种脂激酶是否作用于MAP4K3的上游或下游，因此这两种可能性都被指出。由于4E-BP1的磷酸化（在Thr70mTORC1[15]）调控的位点也受MAP4K3调控，MAP4K2活性对雷帕霉素不敏感，我们认为MAP4K4可能通过作用于mTORC1上游来调节S6K和4E-BP1活性。
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