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.2006年12月1日；41(11):1645-54.
doi:10.1016/j.freeradbiomed.2006.07.023。 Epub 2006年9月9日。

基础活性氧决定肝硬化肝细胞凋亡的易感性

杰·拉瓦尔 1, 苏珊·莱曼, 塔卡西·尼塔, 达格马拉·莫胡奇, 约翰·莱马斯特斯, Jae-Sung Kim（金在成）, 凯文·贝尔斯
附属公司

碱性活性氧物种决定肝硬化肝细胞凋亡的敏感性

杰·拉瓦尔等。 自由基生物医学. .

摘要

肝硬化小鼠肝脏的肝细胞表现出基础ROS活性增加和对TGF-β诱导的凋亡的抵抗，然而当抗氧化预处理降低ROS水平时，这些细胞恢复了对凋亡刺激的敏感性。为了进一步研究这些氧化还原事件，在TGF-β治疗之前，用各种抗氧化剂对肝硬化小鼠肝细胞进行预处理，并评估ROS活性、凋亡反应和线粒体ROS生成。此外，用低剂量H（2）O（2）和ROS处理正常肝细胞，并测定凋亡反应。用各种抗氧化剂治疗肝硬化肝细胞可降低基础活性氧，并使其易于凋亡。共焦显微镜对正常肝细胞的检查显示ROS活性和呼吸线粒体共定位。对肝硬化肝细胞的基本评估显示非局部ROS活性被抗氧化剂消除。在用表达MnSOD的腺病毒进行预处理后，基础肝硬化肝细胞ROS降低，并且存在TGF-β诱导的ROS共定位和线粒体呼吸。用H（2）O（2）处理正常肝细胞后，ROS持续增加，TGF-β细胞凋亡的抵抗力在用抗氧化剂预处理这些细胞时得到逆转。总之，肝硬化肝细胞具有ROS的非局部分布。然而，正常和肝硬化肝细胞表现出ROS的线粒体定位，这是细胞凋亡所必需的。

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数字

图1
图1
（A） 在给药TGFβ（5 ng/ml）之前，用外源性抗氧化剂（包括去铁胺（DEF；1.5mM）、谷胱甘肽（GLUT；5 mM）、DPPD（5μM）或N-乙酰半胱氨酸（NAC；2.5 mM））预处理肝硬化肝细胞1小时，并在给药后90分钟测量ROS活性。ROS活性以fold-difference表示，在时间零点时恢复到基线水平（数据未显示），但对所有测试的抗氧化剂进行TGFβ治疗后活性增加。这些发现表明，肝硬化肝细胞基础活性氧活性增加涉及多种活性氧生成途径。（B） 在使用或不使用TGFβ（5 ng/ml）治疗前，用外源性抗氧化剂（药物和剂量与图1相同）预处理肝硬化肝细胞1小时后，测定浓缩细胞核的百分比，以指示形态学凋亡，并在48小时测定凋亡。单独用抗氧化剂进行预处理并没有诱导细胞凋亡，但抗氧化剂治疗后给予TGFβ显著增加了每种抗氧化剂的肝硬化肝细胞凋亡。
图2
图2
（A） 用表达荧光素酶（AdLuc；对照）、过氧化氢酶（AdCat）或MnSOD（AdMnSOD）的腺病毒（MOI 100）转染肝硬化肝细胞24小时，并用DCF荧光法测定ROS活性。一些肝细胞未经腺病毒治疗（对照）。AdCat和AdMnSOD转染显著降低了ROS的形成（与对照组相比，p＜0.05）。（B） 在TGFβ（5 ng/ml）治疗前24小时，用表达荧光素酶（AdLuc）、过氧化氢酶（AdCat）或MnSOD（AdMnSOD）的腺病毒（MOI 100）转染肝硬化肝细胞，并与DCF孵育。在TGFβ给药后90分钟用荧光法测定ROS的生成，以fold-difference表示。表达抗氧化剂、过氧化氢酶和MnSOD的腺病毒使活性氧在90分钟内爆发，表明肝硬化肝细胞中活性氧对TGFβ的给药反应性。（C） 在用表达荧光素酶（AdLuc）、过氧化氢酶（AdCat）或锰超氧化物歧化酶（AdMnSOD）的腺病毒（100 MOI）预处理24小时后，用TGFβ（5 ng/ml）或不加TGFβ处理48小时，测定肝硬化肝细胞中浓缩细胞核的百分比，以指示形态学凋亡。用表达抗氧化剂、过氧化氢酶和MnSOD的腺病毒转染肝硬化肝细胞，然后用TGFβ治疗，与对照组相比，凋亡肝细胞的百分比显著增加（p<0.05）。
图3
图3
在用TGFβ（5 ng/ml）治疗前，用表达荧光素酶（AdLuc）、过氧化氢酶（AdCat）或锰超氧化物歧化酶（AdMnSOD）的腺病毒（100 MOI）转染24小时的肝硬化肝细胞，在48小时通过免疫印迹法评估caspase-3的裂解，以确认细胞凋亡。（A） 用AdLuc单独转染肝硬化肝细胞（通道1），AdLuc随后转染TGFβ（通道2），AdMnSOD单独转染（通道3），或AdMnSOD随后转染转化生长因子β（通道4）。正如预期的那样，只有AdMnSOD感染后再进行TGFβ治疗，才产生表明caspase-3活性的裂解产物。（B） 用AdLuc单独转染肝硬化肝细胞（通道1），AdLuc随后转染TGFβ（通道2），AdCat单独转染（通道3），或AdCat随后转染转化生长因子β（通道4）。裂解的caspase-3片段仅存在于经TGFβ处理的AdCat感染的肝细胞中。（C） 在使用或不使用TGFβ（5 ng/ml）治疗之前，在48小时时测量Caspase-3活性（以fold-difference表示），以确认转染表达荧光素酶、过氧化氢酶或MnSOD的腺病毒（100 MOI）24小时的肝硬化肝细胞中的凋亡细胞死亡。单独感染腺病毒不会改变caspase-3活性，而用表达抗氧化剂的腺病毒（AdCat和AdMnSOD）转导肝硬化肝细胞后再转导TGFβ，caspase-2活性显著增加。（D） 在TGFβ治疗（5 ng/ml）前24小时，用表达荧光素酶（AdLuc）、过氧化氢酶（AdCat）或MnSOD（AdMnSOD）的腺病毒（MOI 100）感染肝硬化肝细胞48小时后，测定浓缩细胞核的百分比。在使用或不使用TGFβ治疗之前，这些肝细胞也用泛酶抑制剂zVAD（5μM）预处理一小时。zVAD预处理抑制了感染AdCat和AdMnSOD的肝硬化肝细胞的凋亡，证实了caspase介导的细胞死亡形式。
图4
图4
正常和肝硬化肝细胞被荧光团H负载2-DCFDA（2μM；绿色）评估ROS形成，MitoTracker Red（MTR 500 nM；红色）定位呼吸线粒体。TGFβ（5 ng/ml）给药后90分钟进行共聚焦显微镜检查。（A） 未经治疗，对正常（左）和肝硬化（右）肝细胞进行成像。注意正常肝细胞线粒体ROS形成低，而肝硬化肝细胞ROS形成弥散。（B） 用TGFβ处理正常肝细胞90分钟。在TGFβ治疗前，用AdMnSOD转染部分肝细胞24小时。共聚焦成像显示线粒体中ROS爆发（黄色荧光，左图），AdMnSOD转染抑制了ROS爆发（中右图）。（C） 肝硬化肝细胞的共焦成像。仅TGFβ并没有引起线粒体ROS爆发（左图）。尽管AdMnSOD单独使用（中间面板）降低了ROS生成，但随后TGFβ的给药诱导了线粒体ROS爆发（黄色，右侧面板）。（D） 黄色荧光的定量，这是用TGFβ、AdMnSOD或TGFβ和AdMnSOD处理的对照和肝硬化肝细胞线粒体ROS生成的指示。
图5
图5
（A） 从正常和肝硬化肝脏制备全组织裂解物，并通过Western blot分析测定Bcl-xL和MCL-1的水平。肌动蛋白水平也进行免疫印迹，以确保蛋白质负载量相等。（B） 如材料和方法中所述，在有或无5 ng/ml TGFβ的情况下，在HDM中培养从正常和肝硬化肝分离的肝细胞。48小时后，制备细胞裂解物，并用光谱法测定总蛋白酪氨酸磷酸酶活性。
图6
图6
（A） 在正常人、肝硬化人和正常人的体内测定了随时间变化的活性氧荧光单位（FU）2O（运行）2-转化的肝细胞。正常肝细胞（开环）的ROS活性基础水平较低，而肝硬化肝细胞（黑钻石）的ROS活性稳定水平较高。正常肝细胞暴露于10μM H2O（运行）2持续10分钟（黑色三角形）未能维持ROS持续反应。然而，暴露于10μM H的正常肝细胞2O（运行）2在研究期间，20分钟（黑色方块）的ROS活性持续增加，与基底部肝硬化肝细胞相似。这些肝细胞的存活率为97%（数据未显示）。（B） 在正常和H中测定了凝聚核的百分比2O（运行）2-用trolox（2μM）预处理（或不预处理）后48小时转化肝细胞，然后用或不用TGFβ（5 ng/ml）治疗。H治疗2O（运行）2单独使用不会增加细胞凋亡，与肝硬化肝细胞类似，H2O（运行）2-转化细胞在48小时时对TGFβ诱导的凋亡具有抵抗力。然而，H2O（运行）2-转化生长因子β暴露前用trolox预处理的转化肝细胞发生凋亡，与正常肝细胞对照组和抗氧化剂处理的肝硬化肝细胞相似。
图7
图7
将从正常肝脏分离的肝细胞与5 ng/ml TGFβ孵育24 h。在给予TGFβ之前，用30μM 2,3-二甲氧基-1,4-萘醌（DMNQ）处理一些肝细胞20 min。洗涤一次后，用TGFβ进一步孵育肝细胞。如材料和方法中所述，通过PI染色的细胞核（箭头）的染色质浓缩和核碎裂来评估细胞凋亡。TGFβ单独诱导了大量细胞凋亡（a），而DMNQ（B）的短暂治疗可以逆转这种凋亡。
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