Dysfunctional KEAP1-NRF2 interaction in non-small-cell lung cancer

doi:10.1371/journal.pmed.0030420

.2006年10月；3（10）：e420。

doi:10.1371/journal.pmed.0030420。

非小细胞肺癌中KEAP1-NRF2相互作用的功能障碍

安居·辛格¹, 维卡斯·米斯拉, 拉杰什·K·蒂姆穆拉帕, 汉娜·李, 史蒂芬-亚梅斯, 穆罕默德·奥霍克, 詹姆斯·赫尔曼, 斯蒂芬·巴林, 大卫·西德兰斯基, 爱德华·加布里尔森, 马尔科姆·V·布鲁克, 希亚姆·比斯瓦尔

附属公司

PMID： 17020408
预防性维修识别码：项目经理1584412
内政部： 10.1371/日志.pmed.0030420

非小细胞肺癌中KEAP1-NRF2相互作用的功能障碍

安居·辛格等。公共科学图书馆医学. 2006年10月.

.2006年10月；3（10）：e420。

doi:10.1371/journal.pmed.0030420。

作者

安居·辛格¹, 维卡斯·米斯拉, 拉杰什·K·蒂姆穆拉帕, 汉娜·李, 史蒂芬-亚梅斯, 穆罕默德·奥霍克, 詹姆斯·赫尔曼, 斯蒂芬·B·贝林, 大卫·西德兰斯基, 爱德华·加布里尔森, 马尔科姆·V·布鲁克, 希亚姆·比斯瓦尔

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学彭博公共卫生学院环境健康科学系。

PMID： 17020408
预防性维修识别码：项目经理1584412
内政部： 10.1371/日志.pmed.0030420

摘要

背景：核因子类红细胞2相关因子2（NRF2）是一种氧化还原敏感性转录因子，能正向调节编码抗氧化剂、外源性解毒酶和药物外排泵的基因的表达，并对正常细胞中的氧化应激和外源性物质提供细胞保护。Kelch-like ECH-associated protein 1（KEAP1）通过靶向蛋白酶体降解负调控NRF2活性。细胞抗氧化剂和外源性解毒酶的表达增加与肿瘤细胞对化疗药物的耐药性有关。

方法和发现：在这里，我们报告了对肺癌患者和细胞系中KEAP1基因组位点的系统分析，结果显示KEAP1功能重要域中的缺失、插入和错义突变，19p13.2杂合性丢失的百分比很高，提示肺癌中KEAP1的双等位基因失活是常见事件。对12个细胞系和54个非小细胞肺癌（NSCLC）样本中的KEAP1进行测序，发现KEAP1在总共6个细胞系及10个肿瘤中的体细胞突变频率分别为50%和19%。所有突变都位于KEAP1蛋白的Kelch或干预区域域中高度保守的氨基酸残基内，这表明这些突变可能会消除KEAP1阻遏活性。对19p13.2杂合性缺失的评估显示，61%的NSCLC细胞系和41%的肿瘤样本中存在等位基因缺失。癌细胞中KEAP1活性降低导致NRF2的核聚积增加，导致抗氧化剂、外源性代谢酶和药物外排泵的转录诱导增强。

结论：据我们所知，这是首次证明KEAP1双等位基因失活是非小细胞肺癌的常见遗传改变。KEAP1功能的丧失导致癌症中NRF2介导的基因表达的结构性激活，这表明肿瘤细胞操纵NRF2通路以对抗化疗药物生存。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。人KEAP1蛋白保守结构域示意图**
该蛋白质由N末端区域（氨基酸1-60）、BTB结构域（氨基酸61-179）、中心IVR（氨基酸180-314）、包含六个Kelch基序的双甘氨酸丰富区域（氨基酸315-359、361-410、412-457、459-504、506-551和553-598）和C末端结构域（胺基酸599-624）组成。每个域中检测到的突变频率如下所示。突变的氨基酸位置如表1所示。

**图2。身体变化*KEAP1公司*在肺癌中**
（A） 19p13.1–13.3区域的LOH。热图描绘了181个肺癌细胞系中19p13.1–19p13.3处基于微卫星的LOH。不包括对该区域没有信息的肿瘤衍生细胞系。显示杂合型的微卫星标记用红色表示，显示纯合型的标记用绿色表示，非形成型标记用黑色表示。每个垂直列表示一条单元格线。内分泌肿瘤；NS，未指定子类型；鳞状细胞癌，小细胞癌。（B）的序列分析*KEAP1公司*肺癌的突变。第a部分显示了H838细胞系，该细胞系显示C-a替换（G-T，正链），导致终止密码子。野生型序列来自BEAS2B。在H838中未检测到野生型等位基因。第b部分显示PF-8的PF DNA样本中一个等位基因中存在18-bp缺失，而其他等位基因没有。c部分显示肿瘤PT-23，在一个等位基因中显示A-T替代，但在其他等位基因没有。第d部分显示的是*KEAP1公司*在PT-17的一个等位基因中检测到。通过亚克隆和测序确认显示缺失突变的样本。（C） LOH在*KEAP1公司*人类原发性肺肿瘤的基因座。39例非小细胞肺癌LOH模式总结。保留的微卫星以红色表示，标记以绿色表示等位基因丢失，标记以白色表示基因组不稳定，非形成性标记以黑色表示。*KEAP-UM1公司*（加利福尼亚州₁₇)位于*KEAP1公司*轨迹，以及*KEAP-DM1公司*（加利福尼亚州₂₁)位于*KEAP1公司*轨迹。

**图3。非小细胞肺癌中功能失调的KEAP1–NRF2相互作用**
（A）非小细胞肺癌组织中NRF2的免疫组织化学分析。a部分显示了一名患者（PT-18）在*KEAP1型*显示出强烈的细胞核和细胞质染色。b部分显示患者突变阴性（PT-28），细胞质染色较弱。c部分显示患者突变阴性（PT-20），肿瘤组织中的细胞核和细胞质染色增强。d部分显示同一患者（PT-20）的正常支气管呈弱染色。（B） NSCLC和匹配正常组织中的总GSH和NQO1的酶活性以及总GST。热图的原始数据如表S4.*所示，样品窝藏*KEAP1公司*突变；§，nmol/mg蛋白质；†，nmol DCPIP减少/min/mg蛋白质；，nmol形成的产物/min/mg蛋白质。

**图4。癌细胞中KEAP1和NRF2的状态改变**
（A）免疫印迹显示NRF2在癌细胞核提取物（NE）中的核定位增加。癌细胞总蛋白裂解物（TP）中KEAP1水平较低（~69 kDa），NRF2水平较高（~110 kDa。NIVT和KIVT分别表示NRF2和KEAP1体外转录/翻译产物。（B和C）免疫印迹中NRF2和KEAP1蛋白的定量。对于条带密度测定，核提取物印迹（B）中的条带归一化为层粘连蛋白B1，总蛋白（C）中的那些条带归一化为GAPDH。（D）显示相对表达式的热图*KEAP1、NRF2、，*和NRF2依赖基因。热图的原始数据如表S5所示。

**图5。癌细胞与正常细胞总谷胱甘肽水平、GST、NQO1和GSR酶活性的比较**
所示为GST（B）、NQO1（C）和GSR（D）的总GSH水平（A）和酶活性。数据表示平均值±SD(*n个=*3). *,*第页=*0.0016; **,*第页=*0.039; ***,*第页=*相对于正常细胞0.011（通过t吨-测试）。

**图6。突变KEAP1蛋白无法抑制NRF2活性**
（A）通过荧光素酶报告试验监测KEAP1突变体的抑制活性。野生型和突变型*KEAP1公司*将cDNA构建物转染到稳定表达ARE荧光素酶报告子的H838细胞上。数据表示平均值±SD(*n个=*3). （B）的静音*NRF2级*A549细胞中的siRNA下调NRF2依赖基因的表达。使用非特异性siRNA（NS-siRNA）作为对照。（C）抑制*KEAP1公司*BEAS2B细胞中siRNA的表达上调了NRF2依赖基因的表达。

**图7。NRF2活性增加导致耐化学性**
将BEAS2B细胞和癌细胞暴露于足叶乙甙（A）或卡铂（B）72 h，用MTT法检测活细胞。BEAS2B细胞表现出更强的敏感性，而KEAP1活性失调的癌细胞表现出对足叶乙甙和卡铂治疗的化疗敏感性降低。数据以活细胞相对于车辆处理对照的百分比表示。数据是八个独立重复的平均值，结合起来生成每个浓度的平均值±SD。

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1. Tew KD公司。谷胱甘肽相关酶在抗癌药物耐药性中的作用。1994年癌症研究；54:4313–4320.-公共医学
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