跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2006年6月；26(11):4316-26.
doi:10.1128/MCB.02183-05。

多位点蛋白激酶A和糖原合成酶激酶3β磷酸化通过SCFbetaTrCP导致Gli3泛素化

丹尼斯·坦佩 1, 玛丽亚娜·卡斯, 索尼娅·卡拉兹, 玛丽·弗朗索瓦斯·布兰切特·托尼尔, Jean-Paul协和式飞机
附属公司

多位点蛋白激酶A和糖原合成酶激酶3β磷酸化通过SCFbetaTrCP导致Gli3泛素化

丹尼斯·坦佩等。 分子细胞生物学. 2006年6月.

摘要

Gli3是一种锌指转录因子，在蛋白质水解过程中被加工成缺乏C末端激活域的截断阻遏物。Gli3的加工受蛋白激酶A（PKA）的刺激，并受Hedgehog信号通路的抑制，Hedgehong信号通路是脊椎动物发育和疾病的主要信号通路。我们在此表明，Gli3加工需要多位点糖原合成酶激酶3beta（GSK3beta）磷酸化和SCFbetaTrCP泛素化。我们在Gli3中发现了多个与DSGX2-4S基序相关的βTrCP结合位点，这些位点与PKA和GSK3beta位点以及对加工至关重要的SCFbetaTrCP靶赖氨酸交织在一起。我们的结果支持一个简单的模型，即PKA通过GSK3beta和CK1触发Gli3磷酸化级联，从而导致SCFbetaTrCP直接结合和泛素化。还观察到βTrCP与缺乏DSGX2-4S相关基序的Gli3 N端和C端结构域的结合，这可能反映了通过Hedgehog信号的其他成分（如肿瘤抑制因子Sufu）的间接相互作用。因此，Gli3加入了一小组转录因子，其处理受到泛素-蛋白酶体途径的调节。我们的研究揭示了PKA磷酸化在Gli3加工中的作用，并将有助于分析Hedgehog信号如何实现Gli3处理的剂量依赖性调节。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
PKA和GSK3β刺激截断的Gli3合成。（A） 通过PKA和GSK3β刺激刺激截断的Gli3合成。用Flag表位标记的Gli3（Flag-Gli3）、人PKA催化亚单位（PKA）、人野生型GSK3β或人显性阴性GSK3α（GSK3？R85）的表达载体转染NIH 3T3细胞，并用抗Flag抗体对细胞提取物进行免疫印迹分析。（B） LiCl抑制内源性GSK3β抑制forskolin诱导的截短Gli3合成。用Flag-Gli3表达载体转染NIH 3T3细胞。如有指示，用50μM毛喉素（FSK）单独或用50μM FSK和20mM LiCl处理细胞12小时。向对照细胞中加入相同量的FSK载体（乙醇）。（C） PKA位点附近GSK3β位点的突变抑制截短Gli3的合成。GSK3β磷酸化丝氨酸或苏氨酸残基，这些残基位于磷丝氨酸的四个N末端。GSK3β位点SXXXPS，标记为G2至G4，分别与PKA位点P2至P4相邻（29）。将Flag-Gli3指定位点的丝氨酸-丙氨酸突变体与PKA和GSK3β表达载体一起转染到NIH 3T3细胞中，并用抗Flag抗体通过免疫印迹分析细胞提取物。扫描自动放射自显影图，测量与截断的Gli3和总Gli3信号相对应的信号。截断Gli3的相对水平以每种条件下测得的总（截断+全长）Gli3信号的百分比表示。减号表示未量化截断产品的车道。在长时间接触斑点后，可以检测到低水平的加工，粗略估计低于总Gli3的3%。mG2、mP2和mP2P3分别表示G2位点、P2位点以及P2和P3位点的突变Flag-Gli3。
图2。
图2。
截短的Gli3合成需要βTrCP。（A） 野生型βTrCP的过度表达刺激转录阻断实验中截短Gli3的合成。用pBI-G-Flag-Gli3、pTet-Off和GSK3β表达载体以及对照（−）或HA表位标记的βTrCP（HA-βTrCP）表达载体转染NIH 3T3细胞。用50μM forskolin（FSK）和100 ng/ml多西环素（DOX）处理细胞，并在0 h、4 h和8 h后收集，以分析截短与全长Flag-Gli3的相对水平。（B） βTrCP下调抑制Gli3处理。将抗人βTrCP（+）或荧光素酶（−）的siRNA与Flag-Gli3、PKA和GSK3β表达载体一起转染HeLa和293T细胞。右侧面板显示siRNA对抗βTrCP对HA-βTrCP的特异性下调。将抗βTrCP（+）或荧光素酶（−）的siRNA与HA-βTrCP表达载体一起转染293T细胞。用抗HA抗体检测等量的细胞裂解物，检测HA-βTrCP和抗-β-半乳糖苷酶（βGal），作为转染和巨细胞病毒表达水平的控制。（C） MG132蛋白酶体抑制剂抑制Gli3加工。用Flag-Gli3、PKAc和GSK3β表达载体转染NIH 3T3细胞。用20μM MG132（+）或载体（−）处理细胞6 h，并通过反标记免疫印迹分析等量的细胞裂解物。
图3。
图3。
Gli3与βTrCP相互作用。（A） 内源性Gli3与HA-βTrCP相互作用。用HA-βTrCP表达载体转染C3H-10T1/2细胞。将来自四个C3H-10T1/2细胞板的细胞裂解液分成两半，并使用对照（αCtAb，对照FGF4R抗体）或抗Gli3N抗体进行平行免疫沉淀。免疫沉淀物用抗HA抗体免疫印迹法检测HA-βTrCP或用抗Gli3抗体检测内源性Gli3。IP，免疫沉淀。（B） HA-βTrCP与Flag-Gli3共免疫沉淀。将HA-βTrCP表达载体和对照Flag或Flag-Gli3表达载体与PKA和GSK3β表达载体一起转染NIH 3T3细胞，以刺激截短Gli3的合成。等量的细胞裂解物进行反标记免疫沉淀，并通过免疫印迹法进行分析。（C） Gli3与HA-βTrCP共免疫沉淀的三个不同区域。将表达载体与PKA和GSK3β表达载体一起转染NIH 3T3细胞，以刺激截短Gli3的合成。质粒混合物包含HA-βTrCP或βTrCP-myc表达结构，后者在共免疫沉淀实验中用作阴性对照。使用抗-HA抗体对细胞裂解物进行βTrCP免疫沉淀，然后进行抗Flag或抗-HA免疫印迹。在底部面板中，显示了不同的构造。指出了合成截断Gli3（垂直条）所必需的PKA位点P1至P6的位置以及负责DNA结合（ZF）的锌指区域。通过与HA-βTrCP共免疫沉淀分析推断出的βTrCP结合位点用加号表示。未显示证明Gli3ΔN包含两个与βTrCP独立结合的位点的实验（然而，Gli3中央686-1100结构域与βTrCR结合，见图5）。在PKA和GSK3β的刺激下，Gli3ΔN生成了一个截断形式，该形式不与βTrCP结合，很可能是由于缺乏N末端βTrCP相互作用域。在与Gli3位置461至880相对应的通道中，我们检测到截短产物的水平很低，这可能是由于低水平的本构加工，因此不受PKA、GSK3β或βTrCP过度表达的调节（数据未显示）。wt，野生型；Nter，N端子；Cter，C端子。
图4。
图4。
Gli3 N端和C端结构域是高效处理所必需的。使用PKA和GSK3β表达载体将所示构建物转染到NIH 3T3细胞中，并通过免疫印迹分析截短（trunc）和全长产物的相对水平，如图1图例所示。mP2P3表明PKA位点P2和P3的丝氨酸-丙氨酸突变。
图5：。
图5：。
PKA位点突变对βTrCP与Gli3中央686-1100结构域结合的影响。（A） 用HA-βTrCP、PKA和GSK3β表达载体以及野生型Gli3中央686-1100结构域、突变型Gli3-中央686-100结构域或对照（ct）表达载体转染细胞。细胞裂解物进行抗病毒免疫沉淀（IP）并进行免疫印迹分析。（B） 使用PKA和GSK3β表达载体将所示构建物转染到NIH 3T3细胞中，并通过免疫印迹分析截短产物和全长产物的相对水平，如图1图例所示。mG2、mP2和mP2P3分别表示G2位点、P2位点以及P2和P3位点的突变Flag-Gli3。
图6。
图6。
Gli3处理需要βTrCP的直接结合。（A） 与DSGX相关的四个序列基序的鉴定2-4SβTrCP结合位点位于PKA位点P1和P4之间。SCF公司βTrCP先前识别的基板包含DSGX2-4βTrCP结合所必需的磷酸化的S序列。图中下划线的序列基序β1至β4与DSGX有关2-4用黑体表示的残留物对齐的S图案。对方框所示的16氨基酸序列进行突变，以测试基序β4在βTrCP的加工和结合中的作用。（B） 基序β4突变对Gli3加工的影响。用PKA和GSK3β表达载体将指示的构建物转染NIH 3T3细胞，并通过免疫印迹分析截短和全长Gli3的相对水平。所测试的结构包含斜体所示的含有基序β4的16-氨基酸盒的突变。β-连环蛋白（βcat）βTrCP结合位点的定位使得关键丝氨酸有望在PKA磷酸化位点P4后通过GSK3β的顺序活性磷酸化（即在模拟其正常磷酸化的环境中[1]）。突变的β-catenin基序不结合βTrCP（15，36）。（C） β4基序突变对βTrCP与Gli3中央686-1100结构域结合的影响。如图所示，用HA-βTrCP、PKA和GSK3β表达载体以及野生型（wt）或突变型（mut）Gli3中央686-1100域表达载体或对照表达载体（ct）转染NIH 3T3细胞。细胞裂解物进行抗病毒免疫沉淀（IP）并进行免疫印迹分析。显示了联合免疫沉淀（coIP）HA-βTrCP免疫印迹的短期和长期暴露。（D） 基序β1+β2和β3突变对Gli3在其自然背景下（上面板）或替换基序β4时（下面板）的加工的影响。用PKA和GSK3β表达载体将指示的构建物转染NIH 3T3细胞，并通过免疫印迹分析截短和全长Gli3的相对水平。mP2P3表示PKA位点P2和P3处的突变Flag-Gli3。
图7。
图7。
鉴定SCF泛素化的Gli3加工所必需的赖氨酸βTrCP（A）单个或多个赖氨酸-精氨酸突变对Gli3加工的影响。指出了赖氨酸在加工和泛素化中潜在作用的测试位置。含有βTrCP结合基序β1至β4的846至910位结构域不含任何赖氨酸。该域附近的赖氨酸由一条垂直线表示。用PKA和GSK3β表达载体将指示的构建物转染NIH 3T3细胞，并通过免疫印迹分析截短和全长Gli3的相对水平。（B） 赖氨酸773、779、784和800对Gli3ΔNΔC的泛素化至关重要[461,1100]βTrCP过度表达对其刺激。指示的Gli3或Gli3ΔNΔC[461,1100]将构建物与PKA、GSK3β、HA-ubiquitin和对照或myc-βTrCP表达载体一起转染NIH 3T3细胞。用蛋白酶体抑制剂MG132在20μM下处理细胞4小时，该抑制剂抑制如图2C所示的蛋白水解过程，有利于检测泛素化蛋白，并在95°C下在含有5%SDS的裂解缓冲液中裂解细胞10分钟。将所得提取物用抗Flag抗体进行免疫沉淀，并用抗HA抗体进行免疫印迹分析，以检测泛素化物种（右面板）或用抗Flug抗体（左面板，标记为“IP Flag，W Flag”）。（C） 赖氨酸773、779、784和800突变为精氨酸不会损害Gli3ΔNΔC的结合[461,1100]至HA-βTrCP。将表达载体与PKA和GSK3β表达载体一起转染NIH 3T3细胞。使用抗HA抗体对细胞裂解物进行βTrCP免疫沉淀（IP），然后进行抗Flag或抗HA免疫印迹。wt，野生型。
图8。
图8。
已知SCF中βTrCP结合基序的比对βTrCP基底。第一个SCFβTrCP识别的基板允许定义通用DSGX2-4S序列，其磷酸化是βTrCP结合所必需的（11）。最近确定的底物中βTrCP结合位点的比对允许提出修订的一致性βTrCP连接基序。关于hCDC25A、Per2、p100、xCDC25A和Wee1A基板，分别参见参考文献、和。
图9：。
图9：。
通过推测的GSK3β、CK1和PKA磷酸化级联实现βTrCP结合位点的磷酸化。PKA磷酸化红色箭头所示的共有RRXS位点中的丝氨酸。GSK3β将丝氨酸四个残基N端磷酸化为磷酸丝氨酸，而CK1将丝氨酸三个残基C端磷酸化成磷酸丝氨酸；二者都可以在引发（1，9，14）后对底物进行多磷酸化。因此，模体β1中的S855可以如下磷酸化：通过PKA启动S852和S855的顺序磷酸化，通过CK1实现S849（P1）磷酸化。模体β2中S856的磷酸化可能如下：PKA通过CK1启动S868，然后通过GSK3β启动S864、S860和S856。除S850和S894（用黑色箭头表示）外，β1至β4基序中的所有丝氨酸（蓝色和绿色箭头分别表示CK1和GSK3β的磷酸化）都可以很容易地提出类似的磷酸化途径。S850和S894缺少丝氨酸n个+4或n个−磷酸化启动的3个位置，其序列上下文与未启动的CK1位点的序列上下文不相似（14）。另一种候选激酶被融合。如果βTrCP可以与重叠的DSS结合，则可能不需要S850磷酸化850ASTIS图案（带S850与共识中的G/A对齐），而不是图8中提出的图案。在任何情况下，P1到P4的65氨基酸片段中的19个丝氨酸，包括βTrCP结合基序β1到β4中的大多数丝氨酸，可能在PKA启动后被GSK3β和CK1磷酸化。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Amit，S.、A.Hatzubai、Y.Birman、J.S.Andersen、E.Ben-Shushan、M.Mann、Y.Ben-Neriah和I.Alkalay。2002.Ser 45β-catenin的Axin介导的CKI磷酸化：Wnt途径的分子开关。基因发育16:1066-1076。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bai、C.B.、D.Stephen和A.L.Joyner。刺猬的所有小鼠腹侧脊髓模式均依赖于Gli，并涉及Gli3的激活功能。Dev.Cell开发小组6:103-115。-公共医学
    1. Busino，L.、M.Donzelli、M.Chiesa、D.Guardavaccaro、D.Ganoth、N.V.Dorrello、A.Hershko、M.Pagano和G.F.Draetta。2003.β-TrCP在S期降解Cdc25A并对DNA损伤作出反应。自然426:87-91。-公共医学
    1. Chen，C.H.，D.P.von Kessler，W.Park，B.Wang，Y.Ma和P.A.Beachy。1999年，在刺猬靶基因表达的转录调控中，Cubitus核贩运中断。电话：98:305-316。-公共医学
    1. Chen，Y.、N.Gallaher、R.H.Goodman和S.M.Smolik。蛋白激酶A直接调节中断肘的活性和蛋白水解。程序。国家。阿卡德。科学。美国95:2349-2354。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语