Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3

doi:10.1073/pnas.0508105102

.2005年11月8日；102(45):16275-80.

doi:10.1073/pnas.0508105102。 Epub 2005年10月26日。

糖原合成酶激酶-3对秀丽隐杆线虫氧化应激防御蛋白SKN-1的调节

Jae Hyung An先生¹, 凯利·弗拉纳斯, 迈克尔·勒克, 井上秀树, 久本直树, 松本圭弘, T Keith Blackwell先生

附属公司

PMID： 16251270
预防性维修识别码：下午1283458
内政部： 10.1073/pnas.0508105102

糖原合成酶激酶-3对秀丽隐杆线虫氧化应激防御蛋白SKN-1的调节

Jae Hyung An先生等。美国国家科学院程序. 2005.

.2005年11月8日；102(45):16275-80.

doi:10.1073/pnas.0508105102。 Epub 2005年10月26日。

作者

Jae Hyung An先生¹, 凯利·弗拉纳斯, 迈克尔·勒克, 井上秀树, 久本直树, 松本国弘, T基思·布莱克威尔

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿Joslin Place One Joslin糖尿病中心发育和干细胞生物学科，邮编02215。

PMID： 16251270
预防性维修识别码：项目经理1283458
内政部： 10.1073/pnas.0508105102

摘要

氧化应激在许多人类疾病和衰老中起着重要作用。在秀丽隐杆线虫中，SKN-1蛋白诱导II期解毒基因转录，这是一种保守的氧化应激反应，是抗氧化应激和长寿所必需的。氧化应激诱导SKN-1在肠细胞核内积聚，这取决于p38丝裂原激活的蛋白激酶信号。在这里，我们表明，在没有应激的情况下，糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的磷酸化阻止SKN-1在细胞核中积累并在肠道中组成性发挥作用。GSK-3位点在哺乳动物SKN-1同源序列中是保守的，表明这种调控水平可能是保守的。如果GSK-3的抑制被阻断，则SKN-1功能仍需要p38信号的背景水平。WT和组成性核SKN-1可相对缓解SKN-1氧化应激敏感性，表明诱导性II期反应可提供最佳应激保护。我们得出结论：（i）GSK-3抑制肠道中SKN-1的活性，（ii）ii期反应整合了多种调节信号，以及（iii）通过抑制这种反应，GSK-3可能影响氧化还原条件。

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数字

**图1。**
*糖原合成酶激酶-3*抑制SKN-1定位和SKN-1靶基因表达。(A类和B类)SKN-1定位于肠细胞核*糖原合成酶激酶-3*(*RNA干扰*)没有压力的动物。*氮气2*Is007[SKN-1:：GFP]，*sek-1（公里4*)Is007[SKN-1:：GFP]，以及*氮气2*将Ex[SKN-1:：GFP S74，340A]L4动物置于含有*大肠杆菌*HT115携带*糖原合成酶激酶-3*dsRNA或对照（L4440）喂食载体。然后将动物在20°C下孵育24小时，并允许产卵。如参考文献所述，将其存活后代作为L4幼虫和年轻成虫对SKN-1:：GFP在肠细胞核中的积累进行评分。“高”表示所有肠细胞核中都存在强烈的SKN-1:：GFP信号，如*gsk-3（RNAi*)显示动物。“中等”是指细胞核SKN-1:：GFP在肠道前部或前部和后部高水平存在，但在肠道中段几乎无法检测到的动物。*第1季度*对a进行编码*秀丽线虫*p38 MAPK激酶，是肠道SKN-1功能所必需的（参见*结果和讨论*)（28）。(C类和D类)*通用条款-1*::*绿色荧光粉*组成性地表示为*gsk-3（RNAi*)动物。*糖原合成酶激酶-3*RNAi是在*通用条款-1*::*绿色荧光粉*，*通用条款-1*::*绿色荧光粉*Δ2,和*通用条款-1*::*绿色荧光粉*Δ*2个月3*应变，如A类和B类，然后是肠道*通用条款-1*::*绿色荧光粉*对F1 L4幼虫和年轻成虫的表达进行评分（11）。“高”表示*通用条款-1*::*绿色荧光粉*出现在前部的高水平，在大部分肠道中都可以检测到，如*糖原合成酶激酶-3*(*RNA干扰*)如图所示。“中等”指动物，其中*gcs-1型*::*绿色荧光粉*在前部和可能在后部出现高水平，但在两者之间未检测到。这个*通用条款-1*::*绿色荧光粉*对照图像中明显的荧光来源于SKN-1非依赖性咽部表达（11）。在A类和C类，上部图像显示荧光，下部图像显示Nomarski成像，每个插图中显示了成对的肠道细胞核（箭头）。

**图2。**
预测的GSK-3磷酸化位点可防止SKN-1:：GFP在肠细胞核中的结构性积累。(A类)SKN-1编码区和突变转基因构建物。预测的编码区域用红色方框表示，未翻译的区域用蓝色方框表示，GFP用绿色方框表示。SKN-1中潜在的GSK-3位点由石灰岩程序（表1）（32）。这些预测的磷酸化残基和启动位点Ser-397（参见*结果和讨论*)分别用SKN-1:：GFP内的丙氨酸取代。(B类——E类)转基因动物分析。(B类)通过注射图中所示的转基因来产生单个转基因系A类与标记一起*角色-6*（pRF4）。如图1所示，对肠细胞核中SKN-1的存在对这些染色体外系进行评分B类。WT中SKN-1:：GFP S393A线的核SKN-1：：GFP显著增加，但没有*sek-1（km4*)背景和SKN-1:：GFP S397A线。(C类——F类)代表性转基因动物的荧光图像如图1所示A类.

**图3。**
通过GSK-3对SKN-1进行磷酸化。(A类)GSK-3磷酸化基序*秀丽线虫*SKN-1在哺乳动物Nrf1蛋白中保守。该基序具有三个预测的GSK-3位点，在结构上与β-catenin中的GSK-3目标基序相似，其中酪蛋白激酶1α在Ser-45启动磷酸化，然后在Thr-41、Ser-37和Ser-33启动GSK-3磷酸化（26）。预测的化合物GSK-3磷酸化基序也存在于哺乳动物Nrf2和同源*果蝇属*蛋白质CNC。每组保存的残留物均装箱。h、人；m、小鼠；r、老鼠。(B类)GSK-3β对SKN-1 Ser-393的磷酸化作用体外GSK-3β磷酸化所示SKN-1肽，前提是磷酸化丝氨酸存在于397位。这种磷酸化依赖于Ser-393的存在。结合在代表性磷酸化测定中的cpm被绘图。(C类)SKN-1与*秀丽线虫*GST-GSK-3融合蛋白体外.

**图4。**
SKN-1可防止氧化应激。(A类)SKN-1:：GFP过度表达可增强抗氧化应激能力。转基因表达的WT和S393A形式的SKN-1:：GFP可相对缓解小鼠的氧化应激敏感性*skn-1号机组*(*zu67号*)突变体，并提供额外的氧化应激保护。所有被分析的动物都携带*角色-6*转基因标记，来源于对*DnT1型*平衡器。因此，控制是指*氮气2*;*角色-6*衍生自*氮气2*;*角色-6*;*DnT1型*/+动物。将单个蠕虫放在含有6.2 mM线虫生长培养基的平板上后，按照显示的时间对其存活率进行评分吨-丁基过氧化氢。在这些应激条件下，SKN-1:：GFP在肠细胞核和*通用条款-1*::*绿色荧光粉*表达增加（数据未显示）。这项具有代表性的实验涉及每组40条蠕虫。误差线表示标准偏差。*P（P）*的值*skn-1号机组*(*zu67号*),*skn-1号机组*(*zu67号*)Ex[SKN-1:：GFP]，以及*skn-1型*(*zu67号*)与对照组相比，Ex[SKN-1:：GFP S393A]分别为0.034、0.007和0.009。(B类)一种在肠道中调节SKN-1的模型。在正常条件下，SKN-1被GSK-3组成性磷酸化，并阻止其在细胞核内积聚。这种抑制依赖于SKN-1的预先启动磷酸化，这表示一个额外的负信号（参见*结果和讨论*)。SKN-1靶基因，表示为*通用条款-1*，然后以非常低的水平表示。在氧化应激条件下，SKN-1的p38通路信号和PMK-1磷酸化显著增加（28）。该信号抵消了GSK-3对SKN-1的抑制作用，并且是SKN-1在细胞核中高水平积聚并诱导II期基因表达所必需的独立信号。这些磷酸化事件任意显示为发生在细胞质中。MAPKKK，MAPK激酶。

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