Inhibition of cystine uptake disrupts the growth of primary brain tumors

doi:10.1523/JNEUROSCI.5258-04.2005

.2005年8月3日；25(31):7101-10.

doi:10.1523/JNEUROSCI.5258-04.2005。

抑制胱氨酸摄取干扰原发性脑肿瘤的生长

胡俊忠¹, 苏珊·A·莱昂斯, 吉娜·M·纳尔逊, 哈希尔·哈姆扎, 坎迪斯·L·格拉德森, G扬西·吉莱斯皮, 哈拉尔德·索尼默

附属公司

PMID： 16079392
预防性维修识别码：项目经理2681064
DOI（操作界面）： 10.1523/JNEUROSCI.5258-04.2005

抑制胱氨酸摄取干扰原发性脑肿瘤的生长

胡俊忠等。神经科学. 2005.

.2005年8月3日；25(31):7101-10.

doi:10.1523/JNEUROSCI.5258-04.2005。

作者

胡俊忠¹, 苏珊·A·莱昂斯, 吉娜·M·纳尔逊, 哈希尔·哈姆扎, 坎迪斯·L·格拉德森, G扬西·吉莱斯皮, 哈拉尔德·索尼默

附属

¹美国阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学Civitan国际研究中心神经生物学系，邮编：35294-0021。

PMID： 16079392
预防性维修识别码：项目经理2681064
DOI（操作界面）： 10.1523/j欧洲科学.5258-04.2005

摘要

神经胶质细胞通过钠依赖性转运蛋白在隔离神经释放的谷氨酸方面发挥着重要作用。令人惊讶的是，这些转运蛋白在胶质源性肿瘤（胶质瘤）中不起作用。相反，胶质瘤释放谷氨酸，导致肿瘤附近神经元兴奋性中毒死亡。我们现在表明，胶质瘤细胞释放的谷氨酸是细胞通过xc-系统摄取胱氨酸的必然副产物，xc-是一种电中性胱氨酸酯交换剂。胱氨酸是谷胱甘肽生物合成的必要前体，谷胱甘苷是一种主要的氧化还原调节分子，可保护细胞免受内源性活性氧物种（ROS）的伤害。胶质瘤细胞，而不是神经元或星形胶质细胞，主要依赖于通过xc系统摄取胱氨酸来合成谷胱甘肽。系统xc-的抑制导致谷胱甘肽的快速消耗，由此导致的活性氧防御的丧失导致半胱氨酸蛋白酶介导的细胞凋亡。如果通过实验恢复谷胱甘肽的状态，或者如果谷胱甘肽被替代的细胞抗氧化剂替代，证实活性氧确实是细胞死亡的介质，那么胶质瘤细胞就可以被挽救。我们描述了两种有效的药物，允许对系统xc-进行药理抑制。其中一种药物，柳氮磺胺吡啶，临床上用于治疗炎症性肠病和类风湿性关节炎。在常用的人脑胶质瘤颅内异种移植动物模型中，通过腹腔注射柳氮磺胺吡啶能够降低肿瘤组织中的谷胱甘肽水平，减缓体内肿瘤生长。这些数据表明，通过药物抑制系统xc-抑制脑胶质瘤细胞对胱氨酸的摄取可能是一种可行的治疗策略，目前已有食品和药物管理局批准的药物。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
系统在胶质瘤中高度表达。一RT-PCR显示了xCT、4F2hc和β-actin mRNA转录物在人脑胶质瘤细胞系（D54-MG、STTG-1、U251-MG和U87-MG）和胶质瘤原代培养物（GBM62）中的表达。用抗4F2hc抗体通过Western blot测定4F2hc的蛋白表达如下所示。b条RT-PCR使用患者活检的RNA提取物进行，并说明了xCT mRNA转录物在肿瘤（ID47、ID34、ID20）以及比较脑组织中的表达，这些脑组织因其他原因进行手术，没有任何恶性肿瘤证据（ID59、ID56、ID78）。***c（c）***、系统调节亚单位4F2hc的表达和Na的⁺-通过Western blot分析比较胶质瘤活检和对照脑组织中依赖性谷氨酸转运体GLT-1的表达。肿瘤活检中GLT-1的表达几乎完全缺失，所有这些组织都显著表达4F2hc。人体活检的来源如下：ID61，22岁白人男性；ID56，未知；ID57，1.5岁西班牙裔男性；ID59，26岁白人女性；ID78，48岁白人女性；ID20，45岁黑人女性；ID21，55岁白人女性；ID25，58岁未知男性；ID34，47岁，未知男性；ID47，38岁白人女性。纸巾是按照伯明翰阿拉巴马大学机构审查委员会的规定获得的。GBM，多形性胶质母细胞瘤。

公式图像 — **图1。**
系统在胶质瘤中高度表达。一RT-PCR显示了xCT、4F2hc和β-actin mRNA转录物在人脑胶质瘤细胞系（D54-MG、STTG-1、U251-MG和U87-MG）和胶质瘤原代培养物（GBM62）中的表达。用抗4F2hc抗体通过Western blot测定4F2hc的蛋白表达如下所示。b条RT-PCR使用患者活检的RNA提取物进行，并说明了xCT mRNA转录物在肿瘤（ID47、ID34、ID20）以及比较脑组织中的表达，这些脑组织因其他原因进行手术，没有任何恶性肿瘤证据（ID59、ID56、ID78）。***c（c）***、系统调节亚单位4F2hc的表达和Na的⁺-通过Western blot分析比较胶质瘤活检和对照脑组织中依赖性谷氨酸转运体GLT-1的表达。肿瘤活检中GLT-1的表达几乎完全缺失，所有这些组织都显著表达4F2hc。人体活检的来源如下：ID61，22岁白人男性；ID56，未知；ID57，1.5岁西班牙裔男性；ID59，26岁白人女性；ID78，48岁白人女性；ID20，45岁黑人女性；ID21，55岁白人女性；ID25，58岁未知男性；ID34，47岁，未知男性；ID47，38岁白人女性。纸巾是按照伯明翰阿拉巴马大学机构审查委员会的规定获得的。GBM，多形性胶质母细胞瘤。

**图2。**
系统抑制选择性降低脑胶质瘤细胞对胱氨酸的摄取并耗尽细胞内谷胱甘肽。一，与(*S公司*)-4-CPG和柳氮磺胺吡啶（SAS）降低了胶质瘤细胞系和原代胶质瘤细胞培养物（GBM62）中胱氨酸的摄取。b条，与D54-MG胶质瘤细胞摄取胱氨酸相比，柳氮磺胺吡啶对皮质星形胶质细胞摄取胱氨酸的影响要小得多。***c（c）***与星形胶质细胞原发瘤细胞相比，皮质神经元对胱氨酸的摄取微不足道。d日，柳氮磺胺吡啶导致D54-MG细胞内谷胱甘肽的时间和剂量依赖性降低。***e（电子）***，星状细胞内谷胱甘肽水平受柳氮磺胺吡啶的影响明显较小。***（f）***，治疗(*S公司*)-4-CPG柳氮磺胺吡啶耗尽胶质瘤细胞中的细胞内谷胱甘肽，但不耗尽皮层星形胶质细胞或神经元。误差条指示SE。

**图3。**
通过系统抑制胱氨酸摄取影响胶质瘤细胞的生长。一,b条，使用(*S公司*)-4-CPG公司(一)或柳氮磺胺吡啶（SAS）(b条)在胶质瘤细胞系和原代培养的胶质瘤细胞中显示出剂量依赖性生长抑制。***c（c）***，然而(*S公司*)-4-CPG不抑制培养的皮层星形胶质细胞或皮层神经元的生长。d日，广谱mGluR拮抗剂E4CPG（0.25 m米)不会抑制细胞生长，1米也不能米谷氨酸逆转(*S公司*)-4-CPG（0.25米米)-诱导生长抑制，表明这些效应不是通过mGluRs介导的。***e（电子）***，外源性我-胱氨酸以剂量依赖的方式克服了(*S公司*)-4-CPG。***（f）***类似地，与谷胱甘肽乙酯（谷胱甘苷的一种膜渗透形式）孵育，通过以下方式克服生长抑制(*S公司*)-D54-MG细胞中的4-CPG或柳氮磺胺吡啶。误差条指示SE。

**图4。**
系统抑制剂阻断DNA合成并增加S期细胞的百分比。一,b条, (*S公司*)-通过ELISA评估4-CPG和柳氮磺胺吡啶（SAS）抑制BrdU掺入D54-MG细胞的染色体DNA(一)或免疫组织化学(b条)（代表性20倍放大图像）。一毫摩尔胱氨酸（Cys）在任何一种药物持续存在的情况下恢复DNA合成(*S公司*)-4-CPG或柳氮磺胺吡啶。DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。***c（c）***，使用基于FACS的碘化丙啶分析测定DNA含量。使用其中一种进行治疗(*S公司*)-4-CPG或柳氮磺胺吡啶显著增加S期细胞数量。误差条指示SE。

**图5。**
胱氨酸摄取抑制导致凋亡细胞死亡。一，使用自由基清除剂治疗，包括维生素E、TMPO(清除剂）和PBN(清除剂）可部分恢复胶质瘤细胞的生长(*S公司*)-4-CPG。b条, (*S公司*)-流式细胞术分析表明，4-CPG导致DNA断裂，这表明细胞凋亡。***c（c）***, (*S公司*)-4-CPG和柳氮磺胺吡啶（SAS）增加caspase-3的活化形式。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抗体可识别形式（32 kDa）和激活形式（17 kDa。d日，泛特异性caspase-3抑制剂Boc-D-FMK（100μ米)0.25m诱导的阻滞细胞死亡米(*S公司*)-4-CPG，进一步表明细胞死亡激活了caspase-3活性，因此推测为凋亡。***e（电子）***细胞死亡也通过使用活/死检测试剂盒（分子探针）进行确认，当通过荧光激活的细胞分选分析细胞时，与主要表达钙黄绿素的活细胞相比，表现为乙炔同二聚体阳性的死细胞数量增加。使用任一药物进行慢性治疗(*S公司*)-4-CPG或柳氮磺胺吡啶诱导细胞死亡，外源性添加胱氨酸可以克服细胞死亡(*S公司*)-4-CPG公司(***c（c）***)或柳氮磺胺吡啶（数据未显示）。误差条指示SE。

**图6。**
柳氮磺胺吡啶（SAS）减缓肿瘤生长体内.一，在CB-17中诱发实验性脑肿瘤*科学情报部*小鼠通过异种移植D54-ffLuc细胞将荧光素酶基因稳定表达到大脑中。确定肿瘤大小体内每7天使用一个生物发光成像系统（IVIS系统；Xenogen）。将动物随机分为三组，每组12只。对照组每天两次腹腔注射1ml生理盐水，两个试验组在1周或3周内注射8mg柳氮磺胺吡啶（在1ml生理盐中）。这两种治疗方案均通过3周的治疗方案减缓肿瘤生长，几乎完全抑制生长。由于仅接受1周治疗以评估对药物的持续反应的动物肿瘤生长加快，因此在第52天将动物再治疗3天。b条在第二组实验中，通过将稳定表达荧光素酶基因的U87-ffLuc细胞异种移植到大脑中，在裸鼠中同样诱导了脑肿瘤。对照组每天两次腹腔注射1ml生理盐水，试验组连续3周注射8mg柳氮磺胺吡啶（在1ml生理盐中），然后每天一次。***c（c）***,d日，30天时获得的相同实验小鼠脑切片的代表性苏木精-伊红染色。切片示例来自盐水对照组(***c（c）***)和8 mg/ml SAS处理(d日)每天两次注射两次（放大1.25倍）后3周。***电子-克***，使用与FITC偶联的抗萤光素酶的免疫细胞化学。抗体染色显示，转染荧光素的人U87-ffLuc细胞在肿瘤生长49天后仍显示荧光素酶表达。***e（电子）***是单独抗荧光素酶的图像，***（f）***是4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）单独的图像，并且克是绿色抗荧光素酶和蓝色DAPI染色细胞核的合并图像。误差条指示SE。

**图7。**
柳氮磺胺吡啶作用的免疫组织化学分析体内肿瘤。一,b条DAB反应免疫组化显示组织坏死区域，使用基于TUNEL技术的ApopTag试剂盒（20倍放大）。一，肿瘤中单个细胞中的棕色反应产物和背景棕色表示盐水对照小鼠坏死（存活50天）。绿色来自甲基绿染色的细胞核。b条同样的染色来自柳氮磺胺吡啶（SAS）治疗的小鼠脑肿瘤（存活56天）。H&E、苏木精和曙红。***c（c）***,d日，盐处理的TUNEL染色（绿色）的代表性示例(***c（c）***)和8mg/ml SAS处理(d日)小鼠，与4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）共染（40倍放大）。***e（电子）***,***（f）***，生理盐水对照组和柳氮磺胺吡啶处理的脑肿瘤切片中Ki67的免疫细胞化学（20倍放大）。Ki-67染色显示肿瘤周围有一个清晰的界限，与GLT-1抗体染色的正常星形胶质细胞相邻，以绿色显示。Ki67阳性细胞呈红色，DAPI将所有细胞核染成蓝色。

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