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比较研究
.2005年5月；79(10):6078-88.
doi:10.1128/JVI.79.10.6078-6088.2005。

尼帕病毒W蛋白的核定位可以抑制病毒和类toll受体3触发的信号通路

梅根·L·肖 1, 华盛顿B Cardenas, 德米特里·扎马林, 帕雷斯, 克里斯托弗·巴斯勒
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尼帕病毒W蛋白的核定位可以抑制病毒和类toll受体3触发的信号通路

梅根·L·肖等。 J维罗尔. 2005年5月.
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摘要

尼帕病毒V和W蛋白由P基因通过RNA编辑编码，具有共同的N末端结构域，但具有独特的C末端结构域。它们分别定位于细胞质和细胞核，并且都被证明是JAK/STAT信号的抑制剂。在这里，我们报告了V和W蛋白也阻断了β-干扰素（IFN-beta）启动子和IFN调节因子3（IRF3）应答的IFN-刺激基因54启动子的病毒激活。令人惊讶的是，只有W蛋白对细胞外双链RNA刺激Toll样受体3（TLR3）的启动子激活表现出强烈的抑制作用。这种活性依赖于W蛋白的核定位。在W蛋白独特的C末端结构域中，我们发现了一个核定位信号（NLS），它需要位于439、440和442位的基本残基。该NLS负责介导W蛋白与核蛋白α3和核蛋白α4的优先相互作用。因此，W蛋白的核定位使其能够靶向病毒和TLR3途径，而细胞质V蛋白仅限于抑制病毒途径。我们认为这种差异部分是由于V蛋白不太能够阻断对激酶TBK-1的信号传导，而V和W都可以阻止启动子对IKKepsilon的反应。我们证明，当TLR3途径受到刺激时，在W蛋白而不是V蛋白存在的情况下，磷酸化IRF3的水平降低，证实了这些蛋白的差异效应，并说明W蛋白介导的抑制是由于活性IRF3的损失。

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图1。
图1。
尼帕病毒W蛋白中NLS的鉴定。（A） 尼帕病毒和亨德拉病毒的W蛋白C末端结构域的氨基酸序列比对。重点介绍了四个富含基本残基的区域（BR1、BR2、BR3和BR4）。为了鉴定NLS，将每个区域中突出显示的残基突变为丙氨酸。（B） 用HA表位抗体间接免疫荧光检测WT V和W蛋白以及突变W蛋白的定位。突变蛋白的命名表明了残基发生突变的基本区域。
图2。
图2。
W蛋白与核蛋白α3和核蛋白α4的优先相互作用依赖于C末端NLS。用所示的FLAG标记的核蛋白-α（Kα）构建物和HA-标记的WT W、WBR3或WBR4构建物转染293T细胞。用FLAG表位抗体免疫沉淀蛋白质复合物。通过SDS-PAGE和抗HA抗体免疫印迹分析蛋白W的共免疫沉淀（上表），而通过抗FLAG抗体免疫印记确认溶血物中核蛋白-α的表达（下表）。
图3。
图3。
Nipah病毒V和W蛋白通过病毒和细胞内dsRNA抑制IRF3应答启动子的激活。（A和B）293T细胞转染IFNβ-CAT（A）或ISG54-CAT（B）报告质粒和指示的表达结构。转染细胞被模拟感染或感染25μl SeV（10血凝单位/ml）。（C） 首先用ISG54-CAT报告质粒和指示表达质粒转染293T细胞，然后在1天后，模拟转染或用20μg poly（I-C）转染。CAT和荧光素酶活性在感染或poly（I-C）转染后1天进行检测，所有数据均表示为相对CAT活性的折叠激活（与未经处理的对照组相比），通过将其归一化为组成表达雷尼利亚荧光素酶控制。误差条表示两个（A和B）或三个（C）实验的平均值±标准偏差（SD）。
图4。
图4。
尼帕病毒W蛋白（而非V蛋白）抑制TLR3信号通路。（A） 用ISG54-CAT报告体构建物、空载体或指示的Nipah表达载体和250 ng TLR3表达质粒转染293T细胞。转染后一天，对细胞进行模拟处理或通过向培养基中添加聚（I-C）（25μg/ml）处理7 h。培养细胞过夜，然后收获并检测CAT和荧光素酶活性。（B） 用ISG54-CAT报告体构建物、空载体或指示的Nipah表达载体和10 ng TRIF表达质粒转染293T细胞。转染后24小时收集细胞，并检测CAT和荧光素酶活性。数据表示为相对CAT活性的折叠激活，通过归一化为组成性表达雷尼利亚荧光素酶控制。（C） 用空载体或指示的Nipah表达载体和10 ng TRIF表达质粒转染293T细胞。转染后12 h收获细胞，通过定量RT-PCR分析总RNA中ISG56的水平(▪) 和ISG54(░⃞) mRNA。误差条表示三个实验的平均值±SD。
图5：。
图5：。
W蛋白对TLR3信号的抑制依赖于其核定位。如图4B所示，通过TRIF的过度表达激活ISG54启动子。V-SV40 NLS和WBR3-SV40 NLS构建物分别包含来自V和WBR3 ORF末端C端SV40 T抗原的NLS。V和W表达结构编码的蛋白质的亚细胞定位显示在相应的折叠激活条之上。误差条表示两个实验的平均值±标准差。
图6。
图6。
V蛋白抑制启动子激活以响应IKKɛ，但不抑制TBK-1。（A） 293T细胞转染ISG54-CAT报告体构建物、空载体或Nipah表达质粒以及100 ng TBK-1(▪) 或IKKɛ(░⃞) 如图所示，表达质粒。转染后一天，收集细胞并检测CAT和荧光素酶活性。数据表示为相对CAT活性的折叠激活，通过归一化为组成表达雷尼利亚荧光素酶控制。（B） 用空载体或Nipah表达质粒和100 ng TBK-1转染293T细胞(▪) 或IKKõ(░⃞) 如图所示，表达质粒。转染后12 h采集细胞，通过定量RT-PCR测定ISG56 mRNA水平来分析总RNA。误差条表示三个实验的平均值±SD。
图7。
图7。
W蛋白诱导磷酸化IRF3的丢失。用1μg IRF3、250 ng TRIF和空载体或HA-标记的V和W表达质粒转染293T细胞。在没有TRIF的情况下，添加4μg HA-V或HA-W质粒。在存在TRIF的情况下，增加HA-V或HA-W质粒（1、2和4μg）的数量，如楔子所示。转染后24小时收集细胞，通过Western blotting分析裂解产物的IRF3、phosIRF3 Ser396、P56、HA-V、HA-W和GAPDH。由TRIF诱导的IRF3的过度磷酸化形式在IRF3面板中用星号表示。
图8。
图8。
病毒和TLR3激活的信号通路的说明，以及尼帕病毒V和W蛋白预计发挥抑制活性的点。dsRNA刺激TLR3激活由适配器TRIF介导的信号级联，并导致激酶TBK-1的激活。TBK-1磷酸化转录因子IRF3，从而激活IRF3应答启动子。尼帕病毒W蛋白靶向该信号通路的核成分，导致磷酸化IRF3的丢失。病毒感染还导致IRF3应答启动子的激活，该途径的核部分可能与TLR3通路的核部分共享，因此W蛋白也能够抑制病毒激活的信号传导。病毒途径中的上游信号事件与TLR3途径中的信号事件不同，因为信号主要由IKKɛ（粗箭头）介导，尽管不能排除TBK-1的一个次要作用（折断箭头）。尼帕病毒V蛋白只能阻止对IKKɛ的反应中的基因激活，因此仅限于阻断病毒途径，可能是IKK的下游。
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