跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2005年4月20日；24(8):1571-83.
doi:10.1038/sj.emboj.7600633。 Epub 2005年3月24日。

GSK3磷酸化在敲击蛋白分析确定的胰岛素和Wnt信号传导中的作用

爱德华·J·麦克马纳斯 1, Kei Sakamoto先生, 劳拉·J·阿米特, 利亚·罗纳尔逊, 纳塔莉亚·夏皮罗, 鲁道夫·马尔克斯, 达里奥·阿莱西
附属公司

GSK3磷酸化在敲击蛋白分析确定的胰岛素和Wnt信号传导中的作用

爱德华·J·麦克马纳斯等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

糖原合成酶激酶（GSK）3的失活被认为在胰岛素和Wnt信号传导中发挥重要作用。为了确定GSK3失活所起的作用，我们制备了纯合敲除小鼠，其中GSK3alpha（Ser21）和GSK3beta（Ser9）上的蛋白激酶B磷酸化位点被改变为Ala。敲除小鼠存活且无糖尿病。使用这些小鼠，我们表明，失活GSK3β而不是GSK3α是胰岛素激活肌肉糖原合成酶的主要途径。相反，我们证明收缩激活肌肉糖原合成酶、胰岛素刺激肌肉葡萄糖摄取或葡萄糖激活肝糖原合酶并不需要对Ser21/Ser9进行GSK3磷酸化。GSK3在Wnt-signaling途径中也受到抑制，其机制尚不明确。在GSK3alpha/GSK3beta纯合敲除蛋白细胞中，Wnt3a通过β-catenin的稳定和Wnt-dependent转录的刺激来诱导GSK3的正常失活。这些结果确立了Ser21/Ser9磷酸化在先前涉及GSK3失活的几个过程中的功能。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
双敲除小鼠的生长和糖代谢。(A类)所示雄性和雌性小鼠在4至16周龄期间每周称重一次。每个点代表平均值±s.e.m.，其中n个是每组分析的小鼠数量。使用学生的t吨-测试。(B)对20周龄小鼠进行葡萄糖耐量试验。小鼠腹腔注射2 mg/g葡萄糖溶液，并在指定时间测定血糖浓度。n个表示每组小鼠的数量。数据以平均值±标准误差表示(C)所示小鼠隔夜禁食16小时（快速）或喂食自由意志（美联储）。测量血糖和血浆胰岛素水平。数据以平均值±标准误差表示，n个，每组动物的数量。（B）和（C）中使用的雄性和雌性小鼠数量大致相等。
图2
图2
GSK3敲除小鼠的PKB和GSK3活性。(A类)将指示的小鼠禁食过夜，并向麻醉小鼠腹腔注射胰岛素（150 mU/g）或生理盐水（0分钟时间点）。在指定的时间（盐水对照为10分钟），快速提取骨骼肌并在液氮中快速冷冻。PKBα活性在其免疫沉淀后进行测定，如材料和方法中所述。每个时间点显示的结果代表三只小鼠的平均值±s.e.m.，每只小鼠检测两次PKBα。通过组织提取物的免疫印迹分析监测PKBα在Ser473的总水平和磷酸化。对于每个时间点，显示了来自三只单独小鼠的肌肉样本。(B)如上所述，除了GSK3α和GSK3β是从所示的胰岛素刺激组织中免疫沉淀出来的，并对其活性进行了测量。数据表示为从三只小鼠分离的肌肉的平均值±标准偏差，每只小鼠进行三次分析。用所示抗体对所示小鼠的肌肉提取物进行免疫印迹，并显示每个时间点三只单独小鼠的样品。在（A）和（B）中，将三组敲除小鼠的分析结果与WT同窝对照小鼠进行比较。由于来自WT对照组的这些数据彼此之间没有显著差异，因此只有WT GSK3α的结果21安/21安图中显示了同床人员的控制装置。
图3
图3
胰岛素对敲除小鼠糖原合成酶的影响。(A类)将指示的小鼠禁食过夜，并向麻醉小鼠腹腔注射胰岛素（150 mU/g）或生理盐水（0分钟时间点）。在指定的时间（生理盐水对照组为10分钟），快速提取骨骼肌并在液氮中快速冷冻。在没有和存在G6P的情况下测量糖原合成酶活性。数据显示为从三只小鼠分离的肌肉的平均值±标准偏差，每只小鼠检测两次±G6P。用识别磷酸化和总糖原合成酶的所示抗体对所示小鼠的肌肉提取物进行免疫印迹。如图2所示，只有GSK3α的WT控制21安/21安如图所示。(B)分离比目鱼肌，并在有或无胰岛素或AR-A014418的情况下培养。孵育1小时后，肌肉在液氮中快速冷冻。如上文（A）所述评估糖原合酶活性。结果显示为每种情况下四块肌肉的平均值±标准差。
图4
图4
肌肉中GSK3α和GSK3β相对水平的量化。(A类)用抗GST抗体对所示量的重组小鼠GST-GSK3α和GST-GSKβ进行免疫印迹分析，以验证亚型或Pan-GSK3亚型抗体的等载量，以确定该抗体对GSK3β和GSK3 a的相对亲和力。免疫印迹的定量使用LI-COR Odyssey红外成像系统进行。用Pan-GSK3亚型抗体对来自三只WT小鼠（总蛋白40μg）的小鼠骨骼肌进行定量免疫印迹分析，定量数据表明GSK3α相对于GSK3β的丰度。(B)如（A）所示，除采用人GST-GSK3α和GST-GSKβ作为表达标准外，还采用免疫印迹分析法分析了三名健康瘦人的骨骼肌（总蛋白30μg）。
图5
图5
敲除小鼠肌肉中糖原水平和葡萄糖摄取的分析。(A类)从所示小鼠中分离比目鱼肌条，并在存在或不存在100 nM胰岛素的情况下测量葡萄糖转运活性。数据以每种基因型五只小鼠肌肉分离的平均值±标准差表示。对于图2，只有GSK3α的WT控制数据21安/21安如图所示。(B)所示小鼠隔夜禁食16小时（快速）或喂食随意（美联储）。处死小鼠，快速提取股四头肌并在液氮中冷冻。骨骼肌中的糖原含量表示为每克肌肉的糖基单位μmol。数据表示为从每组三只小鼠中分离的肌肉的平均值±标准偏差，每组三次进行分析。
图6
图6
肌肉收缩对敲除小鼠糖原合成酶和糖耐量的影响。(A类)麻醉WT和敲除小鼠的一条腿受到就地通过坐骨神经刺激后肢肌肉收缩（C，收缩）10分钟，另一条腿作为非收缩对照（B，基础）。快速提取双腿的红白腓肠肌和趾长伸肌（EDL），并在液氮中快速冷冻。在没有和存在G6P的情况下测量糖原合成酶活性。数据显示为从四只小鼠分离的肌肉的平均值±标准偏差，每只小鼠检测两次±G6P。(B)用所示抗体对所示小鼠的肌肉提取物进行免疫印迹。如图2所示，只有GSK3α的WT控制21安/21安如图所示。(C)GSK3α和GSK3β是从WT和来源于（A）的双敲除蛋白GSK3肌肉中免疫沉淀而来的，并且按照材料和方法中所述的PP1γ磷酸酶的±处理比率来测量活性。数据表示为从两只小鼠分离的肌肉的平均值±标准偏差，每只小鼠进行三次分析。(D类)用所示抗体对WT和敲除小鼠的肌肉提取物进行免疫印迹。胰岛素处理的样品来自于注射了胰岛素的小鼠肌肉，如图2所示。为了比较胰岛素和肌肉收缩反应中PKB的磷酸化水平，显示了短时间和长时间接触免疫印迹。(E类)将指示的小鼠禁食过夜，并测量血糖水平。然后对小鼠进行麻醉，30分钟后，在小鼠腹腔内注射2 mg/g葡萄糖溶液并在指定时间测定血糖浓度后，进行葡萄糖耐量试验。n个表示每组小鼠的数量。数据以平均值±标准偏差表示，每组中雌性和雄性小鼠的数量相似。
图7
图7
敲除小鼠肝糖原合成酶活性和糖原水平分析。(A类)将指示的小鼠禁食过夜，并向麻醉的小鼠腹腔内注射葡萄糖（2 mg/g）或盐水（0 min时间点）。在指定的时间（盐水控制为10分钟），快速提取肝脏并在液氮中快速冷冻。在没有和存在G6P的情况下测量糖原合成酶活性。数据以三只小鼠肝脏分离的平均值±标准偏差表示，每只小鼠检测两次±G6P。用所示抗体对小鼠的肝脏提取物进行免疫印迹。(B)将WT和敲除小鼠禁食16小时（快速）或喂食自由意志（Fed），肝糖原含量定量为每克肝脏μmol糖基单位。数据表示为各组六只小鼠肝脏分离的平均值±标准偏差，每组六只小鼠各进行三次化验。
图8
图8
Wnt灭活敲除ES细胞中GSK3的能力。(A类)WT和双敲除蛋白GSK3α/β21A/21A/9A/9AES细胞在含有Wnt3a的培养基或从非Wnt3a-表达细胞获得的对照培养基中培养。在指定的时间，β-连环蛋白的磷酸化状态通过免疫印迹分析进行评估，该分析使用的抗体在GSK3（S33/37-P，T41-P）靶向的三个残基磷酸化时识别β-连环素。使用LI-COR Odyssey红外成像系统通过免疫印迹分析定量β-catenin的总水平。用识别GSK3磷酸化和总形式的抗体对提取物进行免疫印迹。对每种条件下的重复培养皿进行了分析，并在两个单独的实验中获得了类似的结果。(B)将含有LEF/TCF结合位点的萤火虫荧光素酶报告基因构建物和组成性SV-40 Renilla荧光素酶构建物共同转染ES细胞，以控制转染效率。转染后24小时，将细胞培养在含有Wnt3a的培养基或从非Wnt3a-表达细胞获得的对照培养基中，并测量荧光素酶活性。作为对照，用萤火虫荧光素酶报告子构建物转染细胞，其中LEF/TCF结合位点发生突变（NEG），并与Wnt3a孵育8小时。荧光素素酶活性以任意单位表达，与正常化的未刺激WT细胞中观察到的肾素荧光素酶活性相关。对每种条件下的四个培养皿进行了分析，在两个单独的实验中获得了类似的结果。所示结果为单个实验的平均值±标准差。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Alemany S，Cohen P（1986）磷酸化酶a是糖原和大鼠肝蛋白磷酸酶-1微粒体形式的变构抑制剂。FEBS Lett 198:194–202号-公共医学
    1. Aschenbach WG、Suzuki Y、Breeden K、Prats C、Hirshman MF、Dufresne SD、Sakamoto K、Vilardo PG、Steele M、Kim JH、Jing SL、Goodyear LJ、DePaoli-Roach AA（2001）肌肉特异性蛋白磷酸酶PP1G/R（GL）（G（M））对运动激活糖原合成酶至关重要。生物化学杂志276:39959–39967-公共医学
    1. Bhat R，Xue Y，Berg S，Hellberg S，Ormo M，Nilsson Y，Radesater AC，Jerning E，Markgren PO，Borgegard T，Nylof M，Gimenez-Cassina A，Hernandez F，Lucas JJ，Diaz-Nido J，Avila J（2003）糖原合成酶激酶3特异性抑制剂AR-A014418的结构见解和生物效应。生物化学杂志278:45937–45945-公共医学
    1. Bollen M，Keppens S，Stalmans W（1998），肝脏糖原代谢的特殊特征。生物化学J 336（第1部分）：19–31-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Cline GW，Johnson K，Regittnig W，Perret P，Tozzo E，Xiao L，Damico C，Shulman GI（2002）新型糖原合成酶激酶-3抑制剂对Zucker糖尿病脂肪（fa/fa）大鼠胰岛素刺激葡萄糖代谢的影响。糖尿病51:2903-2910-公共医学

出版物类型

MeSH术语