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.2005年5月；16(5):2325-38.
doi:10.1091/mbc.e04-11-0996。 Epub 2005年2月23日。

分裂酵母减数分裂前期Nuf2-Ndc80复合物的分离从纺锤体释放着丝粒

浅川昭彦 1, 阿基·哈亚希, 原口德子, 平冈靖国
附属公司

分裂酵母减数分裂前期Nuf2-Ndc80复合物的分离从纺锤体释放着丝粒

浅川昭彦等。 分子生物学细胞. 2005年5月.

摘要

在分裂酵母波姆裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中，有丝分裂间期，着丝粒仍然聚集在纺锤体（SPB）上。相反，在减数分裂前期，着丝粒与SPB分离。在这里，我们研究了葡萄球菌减数分裂活细胞中着丝粒蛋白的行为。我们发现，当着丝粒与SPB分离时，Nuf2-Ndc80复合蛋白（Nuf2、Ndc80、Spc24和Spc25）在减数分裂前期从着丝粒中消失。着丝粒蛋白Mis12也在减数分裂前期解离；然而，Mis6在减数分裂过程中一直存在。当细胞通过Pat1激酶（减数分裂的关键负调控因子）失活诱导减数分裂时，着丝粒在减数分裂前期仍与SPB相关。然而，突变导致Nuf2失活，导致pat1突变细胞中SPB的着丝粒释放，这表明Nuf2-Ndc80复合物将着丝粒连接到SPB。我们进一步发现，从着丝粒中去除Nuf2-Ndc80复合物和着丝粒-SPB分离是由交配信息素信号引起的。由于pat1突变细胞在第一次减数分裂中也表现出异常的染色体分离，并且这种异常通过交配信息素信号进行补偿，因此Nuf2-Ndc80复合物的分离可能与减数分裂染色体分离的动粒重塑有关。

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数字

图8。
图8。
这个S.pombe公司动粒结构。在有丝分裂间期，着丝粒和动粒复合体位于SPB附近，包括Nuf2-Ndc80复合体、Mis12复合体和Mis6复合体。在核配和马尾期，Nuf2-Ndc80复合物和Mis12从着丝粒中消失，导致着丝粒-SPB分离。在马尾期晚期，Mis12复合物和Nuf2-Ndc80复合物再次出现在着丝粒上。
图1。
图1。
Nuf2在减数分裂过程中的行为。（A） 有丝分裂生长细胞中的Nuf2-GFP（绿色）和Sad1-DsRed（红色）S.pombe公司菌株（HA252–4A）。细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。棒材，1μm。（B） 活细胞观察S.pombe公司核配和减数分裂前期的Nuf2-GFP。HA252-4A菌株在产孢培养基上培养，获得活合子细胞的延时图像。显示了Nuf2 GFP（绿色）和Sad1 DsRed（品红色）。时间0表示Sad1-DsRed点熔断的时间。虽然Nuf2-GFP从着丝粒消失，但有时在细胞质中观察到微弱的GFP信号（例如，31和42分钟时的帧）；这种细胞质信号可以与着丝粒信号区分开来，因为它们不遵循马尾核运动。棒，10μm。（C） Nuf2在着丝粒的定位。HA525菌株在产孢培养基上培养。Nuf2-CFP（蓝色），岑1-GFP（绿色）和Sad1-DsRed（红色）。棒材，10μm。（D） 观察酿酒酵母Nuf2蛋白在减数分裂前期。酿酒酵母在诱导减数分裂后0和5 h取NKY278菌株，然后制备用于免疫染色。Ndc10蛋白染色作为着丝粒标记。棒材，15μm。
图3。
图3。
Nuf2-Ndc80复合蛋白在核配和减数分裂前期的行为。（A） 观察S.pombe公司Ndc80、Spc24和Spc25蛋白质。在有丝分裂生长的细胞（HA205–2A、HA229–11C和HA485–1D菌株）中观察到Nuf2因子（绿色）和Sad1-DsRed（红色）。细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。棒材，1μm。（B） 核配和减数分裂前期Ndc80、Spc24和Spc25的活细胞观察。HA205–2A、HA229–11A或HA485–1D菌株在产孢培养基上培养，如图1所示，对活合子细胞进行延时观察。Ndc80-GFP、Spc24-GFP或Spc25-GFP（绿色）和Sad1-DsRed（洋红色）显示在合并图像中。棒材，10μm。（C） Nuf2-Ndc80复合蛋白的行为动力学。每隔5分钟记录表达Nuf2-GFP、Ndc80-GFP，Spc24-GFP或Spc25-GFP的细胞的时程图像。马尾期平均分为五个亚期。在每个亚阶段中，计算观察到GFP斑点信号的时间点数量，并除以总时间点数量来计算阳性GFP信号的频率。将百分比绘制为各子阶段的时间进程。检测的活细胞数量：Nuf2-GFP为22，Ndc80-GFP 14，Spc24-GFP 12，Spc25-GFP 11。
图4。
图4。
Mis12和Mis6的行为。（A） Mis12或Mis6在减数分裂前期的定位。Mis12-GFP（HA259–1D，顶部）和Mis6-GFP菌株（HA260–7D，底部）在产孢培养基上培养，观察合子细胞。图中显示了典型的马尾核。Mis12-GFP和Mis6-GFP显示为绿色。SPB用Sad1-DsRed（红色）显示，细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。（B和C）Mis12和Mis6在核配和减数分裂前期的行为。每10分钟在产孢培养基中观察一次Mis12-GFP（HA259–1D）或Mis6-GFP菌株（HA260–7D）的活合子。Mis12-GFP或Mis6-GFP（绿色）和Sad1-DsRed（洋红色）也显示在合并图像中。棒材，10μm。（D） Mis12和Nuf2（左）之间以及Mis6和Nuf2之间的免疫沉淀分析（右）。表达Nuf2-GFP的Mis12和Mis12-HA细胞的提取物（HA282-3D和HA252-12B）以及表达Nuf2-GFP的Mis6和Mis6-HA细胞的萃取物（HA380-11C和HA252-12B）用抗-HA珠培养，沉淀物（IP）用抗GFP抗体进行免疫印迹分析。还分析了全细胞提取物（WCE）。提取物是从生长培养物中制备的。在右侧面板中，P表示沉淀；S、 上清液。（E） Mis6或Mis12与Nuf2-Ndc80复合蛋白之间的酵母双杂交分析。用所示的质粒组合转化酵母菌株，将其置于选择性（顶部）和非选择性培养基（底部）上，并培养3天。
图5。
图5。
中Nuf2的行为第1部分交配信息素信号的突变细胞。（A） 着丝粒和SPB在生活中的位置第1部分在不存在或存在c（c）-类型垫子基因。菌株HA499-1C(小时− 第1-114页)或HA495–9B(小时− 第1-114页加材料-Pc)在26°C条件下因氮饥饿而在G1期被捕。在这些菌株中，使用GFP-LacI（识别lacO序列）显示染色体II的着丝粒区域，使用Sad1-DsRed显示SPB。细胞核用Hoechst33342（蓝色）染色。棒，10μm。（B） 在a.n=100的每个菌株中，着丝粒（cen2）从SPB分离的统计分析。（C） 中Nuf2的行为第1部分-诱导减数分裂。小时− 第1-114页表达Nuf2-GFP（HA309–11C）的细胞在26°C的允许温度下通过氮饥饿在G1中被阻止，然后转移到34°C后观察到Nuf2-GFP。每帧中的数字表示温度变化后的时间（以分钟为单位）。棒材，10μm。（D） 中Nuf2的行为第1部分突变体细胞c（c）-类型垫子基因。A菌株HAR3021-1(小时− 图1-114编号2+-GFP菌株包藏材料-Pc）如C.Bar所述，观察到10μm。（E） 中Ndc80、Spc24、Mis12和Mis6的行为第1部分突变体细胞c（c）-类型垫子基因。Ndc80-GFP、Spc24-GFP，Mis12-GFP和Mis6-GFP在小时− 第1-114页携带材料-Pc在26°C下通过氮饥饿诱导G1期阻滞后的基因（HAR3041-1、HAR3031-1、HA3505C-1和CRLa59-1）。棒材，10μm。
图7。
图7。
着丝粒分离编号2-1中的突变第1部分-诱导减数分裂前期。（A） 减数分裂的进展无人机2+/数字2+和编号2-1/编号2-1背景中的菌株第1部分时间突变（分别为HA529和HA530）。这两个菌株在26°C下通过氮饥饿在G1中被截留，然后转移到34°C。用DAPI染色观察细胞核分裂情况。（B） 着丝粒、SPB和Nuf2的定位。这两个菌株都是在A温度变化后4小时观察到的。用lacO/GFP-LacI方法（Yamamoto和Hiraoka，2003；绿色）显示的II号染色体的近着丝粒区（cen2）、用Sad1-DsRed（红色）显示的SPB和Nuf2-CFP（蓝色）显示为与亮场显微照片合并的图像。棒材，1μm。（C） 着丝粒-SPB分离的频率。在A中温度变化（0 h）后的指定时间点，在每个菌株的细胞中测量着丝粒（cen2）和SPB之间的距离。每个时间点至少观察到100个细胞。cen2-SPB距离大于0.55μm的细胞显示为cen2-SPB-游离细胞。Mann-Whitney进一步比较了两个菌株的cen2和SPB之间的距离U型测试。p值，0小时为0.79，2小时为0.69，4小时为<0.0001。每个图表右侧的数字表示没有检测到Nuf2或Nuf2-1蛋白CFP信号的细胞百分比。（D） 着丝粒-SPB距离的分布。以0.25-μm的间隔绘制以C为单位测量的cen2-SPB距离直方图，并绘制数字2+（蓝色）和编号2-1（红色）0、2和4小时。
图2。
图2。
Nuf2-Ndc80复合蛋白的相互作用。（A） Nuf2-Ndc80复合物的酵母双杂交分析。用所示的质粒组合转化酵母细胞，在选择性（顶部）和非选择性培养基（底部）上发现，并培养3天。使用含有1 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的SD/-Leu、-Trp、-His和-Ade培养基作为选择性培养基。（B） Nuf2-Ndc80复合物的免疫沉淀分析。表达Nuf2-GFP的提取物（HA252-12B和HA374-2C，顶面板）、Spc24-GFP（HA229-1C和HA329-3A，中面板）或Spc25-GFP。所有提取物均从生长培养物中制备，并与抗-HA珠培养。用抗GFP抗体进行Western blotting分析沉淀物（IP）和全细胞提取物（WCE）。
图6。
图6。
（A） Nuf2 HA蛋白在h内的免疫荧光染色− 第1-114页具有材料-Pc（菌株HA626-4D）。在通过氮饥饿诱导G1期阻滞后固定细胞，并进行免疫荧光。观察到200多个细胞检测Nuf2-HA。棒材，1μm。（B） 减数分裂过程中Nuf2的表达。菌株HA626–4D的细胞通过氮饥饿被阻滞在G1中，并通过改变图例至图5所示的温度来诱导其进行同步减数分裂。制备细胞提取物并用抗HA抗体进行免疫印迹分析。作为负荷控制，用抗Cdc2抗体检测Cdc2。用DAPI染色细胞核来监测核分裂动力学。（C） 外源性表达Nuf2的定位。菌株HA478–1C的细胞，在硫胺素可抑制性下表达Nuf2-GFPnmt1（纳米1）将启动子培养在含有或不含硫胺的产孢培养基上，观察减数分裂前期细胞。细胞核用Hoechst-33342染色。箭头表示有丝分裂间期细胞。
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