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.2005年2月;79(4):2079-86。
doi:10.1128/JVI.79.4.2079-2086.2005。

严重急性呼吸综合征冠状病毒抑制β-干扰素诱导提示干扰素调节因子3激活的两步模型

附属公司

严重急性呼吸综合征冠状病毒抑制β-干扰素诱导提示干扰素调节因子3激活的两步模型

马丁·斯皮格尔等。 J维罗尔. 2005年2月.

摘要

严重急性呼吸综合征(SARS)是由一种新型冠状病毒SARS-CoV引起的。我们和其他人之前已经证明,外源性添加干扰素(IFN)可以抑制SARS-CoV的复制,干扰素是一种细胞因子,通常由细胞合成,作为对病毒感染的反应。在这里,我们证明了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒通过阻止IFN-β的诱导而逃脱了IFN-介导的生长抑制。在SARS-CoV感染细胞中,未检测到内源性IFN-β转录物和IFN-β启动子活性。然而,转录因子干扰素调节因子3(IRF-3)对IFN-β启动子活性至关重要,在感染SARS-CoV后早期从细胞质转运到细胞核。然而,在感染后期,IRF-3再次定位于细胞质。相反,IRF-3保留在被IFN诱导的对照病毒Bunyamwera delNSs感染的细胞的细胞核中。IRF-3活化的其他迹象,如过度磷酸化、同型二聚体形成和辅活化因子CREB结合蛋白(CBP)的募集,在感染对照病毒后很晚才发现,但SARS-CoV没有发现。我们的数据表明,IRF-3的核转运是对病毒感染的一种即时早期反应,可能先于其过度磷酸化、同源二聚体形成并与CBP结合。为了避免IFN系统的激活,SARS-CoV似乎阻止了IRF-3早期核运输之后的一步。

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数字

图1。
图1。
SARS-CoV感染细胞中缺乏IFN-β诱导。(a) 干扰素-β启动子激活。在IFN-β启动子的控制下,用含有萤火虫荧光素酶基因的质粒p-125Luc转染人293细胞,并用编码雷尼利亚荧光素酶在组成活性猴病毒40启动子的控制下。转染后6小时,细胞被SARS-CoV或IFN诱导的对照病毒Bunyamwera-delNSs(CTRL)感染或保持未感染状态(模拟)。在感染后18小时,测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶值(反映IFN-β启动子激活)标准化为雷尼利亚荧光素酶活性。(b) 逆转录-PCR分析。通过逆转录-PCR分析感染18 h的293个细胞的总RNA,以检测是否存在干扰素-βmRNA(面板1)、SARS-CoV N基因mRNA(板2)或对照病毒(面板3)或细胞γ-肌动蛋白mRNA(委员会4)。
图2。
图2。
IRF-3在感染早期的亚细胞定位。模拟感染SARS-CoV(图1至图3)或感染SARS-CoV 8小时(图4至图6)或对照病毒(图7至图9)的细胞的共焦双免疫荧光照片。分别用特异性兔和小鼠抗血清检测病毒N蛋白(第4和第7组)和IRF-3(第2、第5和第8组)。
图3。
图3。
感染后期IRF-3的亚细胞定位。如图2所示,细胞被感染16小时并进行免疫染色。
图4。
图4。
IRF-3的过度磷酸化。通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳分析感染8小时(a)或16小时(b)的细胞的提取物,然后进行免疫印迹分析,以检测IRF-3(图1)、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的N蛋白(图2)或对照病毒的N蛋白(图3)。未磷酸化的IRF-3的两种形式用箭头表示,过磷酸化的形式用星号(*)表示。
图5:。
图5:。
IRF-3的均聚。用非变性凝胶电泳分析感染SARS-CoV或对照病毒8小时(a)或16小时(b)的细胞提取物,然后用免疫印迹法检测IRF-3。IRF-3单体和二聚体的位置用箭头表示。
图6。
图6。
IRF-3招募CBP。细胞感染8小时(a)或16小时(b),分析抗CBP免疫复合物(IP)是否存在IRF-3(面板1)和CBP(面板2)。通过检测沉淀后上清液(SN)中的病毒N蛋白来监测感染情况(第3和第4组)。
图7。
图7。
核进出口。(a) IRF-2的核定位。用质粒pEGFP-C1-hIRF-2转染细胞24小时,然后用SARS-CoV重叠感染16小时(右面板)或左未感染(左面板)。用特异性兔抗血清和Cy3-结合二抗检测病毒N蛋白。(b) 核出口分析。用Rev表达构建物pcRev、Rev出口依赖性CAT报告质粒pDM128(19)和雷尼利亚荧光素酶控制质粒pRL-SV40。37°C下4小时后,细胞感染SARS-CoV或保持未感染状态(黑柱)。作为对照,细胞与CRM-1抑制剂钩体霉素B(LMB)平行处理,浓度为2 ng/ml(灰柱)。在感染后16小时,测量报告者的活动。CAT活动标准化为相应的雷尼利亚荧光素酶活性测定诱导。给出了一个典型实验的数据。

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引用人

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