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.2005年2月；25(3):1025-40.
doi:10.1128/MCB.25.3.1025-1040.2005。

抑制宏自噬触发细胞凋亡

帕特里夏·博亚 1, 罗莎·阿娜·冈萨雷斯-波罗, 诺埃利亚·卡萨雷斯, Jean-Luc Perfettini牛仔裤, 菲利普·戴森, 纳撒尼尔·拉罗切特, 迪迪埃·梅蒂维尔, 丹尼尔·梅利, 西尔维·索奎尔, 吉森田松（Tamotsu Yoshimori）, 杰拉德·皮尔龙, 帕特里斯·科多诺, 吉多·克罗默
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抑制宏自噬触发细胞凋亡

帕特里夏·博亚等。 分子细胞生物学. 2005年2月.

摘要

观察到哺乳动物细胞在营养物质耗尽的条件下死亡，同时，宏观自噬受到基因（通过靶向Atg5、Atg6/Beclin 1-1、Atg10或Atg12的小干扰RNA）或药物（通过3-甲基腺嘌呤、羟基氯喹、巴非霉素A1或莫能菌素）的抑制。细胞死亡是通过细胞凋亡（1型细胞死亡）发生的，因为线粒体膜的稳定（Bcl-2或vMIA，一种巨细胞病毒衍生的基因）或胱天蛋白酶抑制可减少细胞死亡。在溶酶体和自噬体融合受到抑制的条件下，LC3-II蛋白的积累、超微结构研究和酸性液泡室的增加表明，自噬液泡的形成在细胞凋亡前阶段增强。然而，表现出类似于（自噬）2型细胞死亡形态的细胞得到了恢复，只有线粒体跨膜电位受损的细胞超出了不可逆点，即使在最佳培养条件下也会不可避免地死亡。总之，这些数据表明，自噬可能具有细胞保护作用，至少在营养物质耗尽的情况下是如此，并指出了1型和2型细胞死亡途径之间的一种重要的相互作用。

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数字

图1。
图1。
HCQ介导的酸性液泡诱导。（A和B）HCQ处理细胞中的真空酸室和凋亡相关参数。HeLa细胞暴露于HCQ（30μg/ml）达指定时间，细胞用LTR、DiOC染色6（3） 、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素或PI，然后进行FACS分析。所示数据为代表性FACS曲线（A）或五个独立实验结果的平均值(x个±平均值标准误差[SEM]）（B）。面板A中的条表示代表每个人口的窗口。CRT，控制。（C） 线粒体稳定蛋白对LTR染色的影响。将稳定转染Bcl-2或vMIA的HeLa细胞与HCQ孵育5h，然后进行LTR染色和FACS分析。仅矢量控制细胞（未发表的结果）表现为结果显示在面板A最左边的图形中的细胞。（D和E）HCQ诱导空泡化的光镜证据。用HCQ处理指定时期的细胞，用Giemsa（D）或Cell Tracker Green CMFDA（E）染色。箭头表示凋亡细胞核。（F） 用LAMP2抗体染色溶酶体。HCQ处理的HeLa细胞进行免疫荧光染色，并用Hoechst 33324进行复染。（G） 空泡化和基质金属蛋白酶的时间层次。细胞用抗细胞色素CMFDA染色c（c）（周期c（c）)抗体（显示为红色荧光）和Hoechst 33342（蓝色荧光），以及空泡化增强、线粒体释放细胞色素的细胞频率c（c），并测定凋亡细胞核(x个±扫描电镜；n个= 4).
图2。
图2。
HCQ诱导的细胞死亡不可恢复点的测定。（A） 亚群的细胞荧光纯化。未经处理（对照）或HCQ处理（8 h，60μg/ml）的细胞同时用LTR、DiOC染色6（3） 和活性染料DAPI。单元格（DAPI上的门控低的正常前向散射事件），然后进行FACS。面板A中显示的门表示FACS分选的群体[对照，结合正常水平LTR的细胞（LTRN个)，长期利率高的和DiOC6（3）低的单元格]。注意LTR的定义高的单元格比图1A中的单元格更具限制性。（B） 在面板A中分类的电池的侧面散射特性（SSC）。CRT，对照。（C） 从面板A和B中所示的此类分选细胞获得的代表性电子显微镜图像。条形图显示为1μm。E、 空泡；N、 核心。箭头表示双层膜。（D） 电子显微镜测定的空泡化模式定量（50次重复）。要么确定每个细胞的小泡数（自噬小泡、AV或空小泡），要么通过形态计量学测量小泡所占细胞体积的百分比。CO，控制。（E） 未经FACS纯化的HCQ（60μg/ml）暴露细胞空泡化模式的定量。（F和G）FACS纯化人群的死亡率。按照面板A所述纯化的细胞要么用DiOC保存6（3） FACS纯化后立即和DAPI或再培养16 h，然后使用DiOC6（3） DAPI染色（F）。请注意，只有DiOC6（3）低的人口往往失去生存能力，成为DAPI高的或者，将细胞离心在载玻片上，进行免疫荧光染色（0 h）或再培养16 h，然后用细胞色素标记c（c）-特异性抗体（G）。具有线粒体细胞色素弥漫染色模式的细胞的频率c（c）面板D中显示了释放(x个±扫描电镜；n个= 3).
图3。
图3。
HCQ抑制自噬。（A） HCQ对蛋白质降解的影响。在CM或NF中培养的细胞中，单独或在存在指示的自噬抑制剂的情况下，测量（54）缬氨酸标记的长寿命蛋白质的比率。CO，控制；Baf、Baf A1；Mon，monensin。（B） HCQ对线粒体和溶酶体共定位的影响。用mtDsRed和溶酶体靶向GFP（SytVII-GFP）转染细胞。20小时后，在有或无HCQ的情况下用NF（2小时）处理细胞，并对细胞进行共焦激光显微镜检查。插入物显示了HCQ处理的营养素缺乏细胞中SytVII-GFP-标记结构的尺寸增加。图（右侧面板）表示为细胞部分确定的荧光分布，如箭头方向所示。（C） 线粒体-溶酶体共定位定量。使用图像分析仪计算重叠百分比，并绘制对照细胞（CM）或在存在指示的自噬抑制剂的情况下饥饿细胞（NF）的重叠百分比。对于对照组与3-MA处理细胞的结果，P（P）<0.05；对照组与Baf A1-、莫能菌素和HCQ处理细胞的结果，P（P）小于0.001。（D） HCQ对LAMP2和LC3-GFP共定位的抑制作用。转染LC3-GFP的细胞（实验开始前24小时）在没有或存在HCQ（30μg/ml）的情况下接受营养饥饿（NF，2小时），并进行免疫染色以检测LAMP2，以显示与LC3-GFP（黄色）的重叠。显示了具有代表性的图像。
图4。
图4。
HCQ和其他自噬抑制剂对自噬空泡标记LC3的亚细胞定位和生化状态的影响。（A和B）用HCQ（A）或一系列已建立的自噬抑制剂（B）处理的对照（CM）和饥饿（NF，6 h）细胞中累积LC3-II蛋白的免疫印迹分析。（C和D）LC3-GFP的再分配。用LC3-GFP嵌合体瞬时转染细胞后24小时，用HCQ、Baf A1、莫能菌素或3-MA处理细胞指定时间（在有血清的C组中24小时）；固定的；并用Hoechst 33342复染。面板C中显示了代表性单元格，以及频率(x个±扫描电镜；n个＝4）具有明显液泡状分布的LC3-GFP（LC3-GFP真空吸尘器)或对凋亡细胞核进行评分。CO，控制；Mon，monensin。
图5：。
图5：。
自噬抑制使细胞对营养素耗竭诱导的细胞死亡敏感。（A） 饥饿诱导的真空化加上自噬抑制。在HCQ、Baf A1、莫能菌素或3-MA存在或不存在（对照[CO]）的情况下，HeLa细胞在CM或NF中培养24小时，最后用CMFDA和Hoechst 33342染色（插图）。请注意，HCQ、Baf A1和莫能菌素增强AV的形成（绿色荧光染色中可见孔洞）并诱导核凋亡。箭头标记凋亡细胞核。（B） 协同细胞死亡诱导的定量评估。在CM或NF中培养的细胞，在存在或不存在所示抑制剂（对照）的情况下，进行染色，以确定ΔΨ的损失米[使用DiOC6（3） ]和生存能力（与PI）。所示数据是五个独立实验±SEM结果的平均值。（C）由营养物质消耗和自噬抑制触发的Caspase-3激活（Casp-3a）。用识别活化酶-3 17-kDa亚单位的抗体对细胞进行染色，并在有或无营养素和自噬抑制剂的培养后对阳性细胞的频率进行评分（如B组所述，24小时）。Ho，Hoechst赫斯特33342；Baf、Baf A1；Mon，monensin。（D） 自噬抑制不会使细胞对STS诱导的细胞死亡敏感。在存在指示抑制剂的情况下，用100 nM STS培养细胞，并按照面板B所述测量细胞死亡相关参数。结果是三到五个独立测定的平均值±SEM。
图6。
图6。
凋亡抑制剂对自噬抑制细胞中饥饿诱导的细胞死亡的影响。（A和B）抑制剂对细胞死亡标记物的影响。仅用载体（Neo）稳定转染的HeLa细胞（Neo-Co），未经处理（Neo-Co），或用泛酶抑制剂Z-VAD-fmk处理的人或转染Bcl-2或巨细胞病毒衍生vMIA的细胞，在指定条件下培养（CM中不饥饿，NF中饥饿），无条件（对照[Co]）或显示的自噬抑制剂存在24小时。然后，细胞百分比(x个±扫描电镜；n个=4）低DiOC6（3） 用细胞荧光法测定掺入（A）和PI-渗透性质膜（B）。Mon，monensin。（C） 凋亡抑制不影响自噬体的积累。用LC3-GFP嵌合体转染细胞（如面板B和C所述的Neo-、Bcl-2-或vMIA-转染细胞），然后在有血清（CM）或无血清（NF）以及有Z-VAD-fmk的情况下用HCQ处理（24小时），然后用Hoechst 33342（Ho）和荧光显微镜进行复染。
图7。
图7。
Bax和Bak的DKO可防止因自噬抑制而加剧的饥饿诱导的细胞死亡。野生型（WT）小鼠胚胎成纤维细胞或Bax和Bak DKO（Bax−/−贝克−/−)成纤维细胞在CM或NF中培养，并与3-MA、Baf A1、莫能菌素（Mon）或HCQ孵育24 h，然后用低浓度DiOC染色6（3） （A）或高浓度PI（B），然后进行细胞荧光分析(x个±扫描电镜；n个= 3). 或者，用CMFDA和Hoechst 333234对细胞进行染色，并在荧光显微镜下观察。显示了莫能菌素和HCQ处理细胞（CM或NF）的代表性图像。CO，控制。
图8。
图8。
Beclin 1的siRNA使细胞对饥饿诱导的细胞死亡敏感。（A） siRNA诱导的Beclin 1下调，通过免疫印迹法在用干扰控制（SC）siRNA或两种不同Beclin 1-1靶向双链寡核苷酸治疗后的指定时间测定。（B） Beclin 1特异性siRNA对NF培养后线粒体（DsRed标记）或溶酶体（GFP标记）共定位的影响。共定位程度(x个±扫描电镜；n个=12），如图3所示。（C和D）Beclin 1敲除使细胞对营养素消耗诱导的细胞死亡敏感。将野生型（C）或转染新霉素耐药基因vMIA或Bcl-2（D）的HeLa细胞暴露于指示的siRNA中，然后在富含营养素（CM）或缺乏营养素（NF）的培养基中培养24小时，在存在或不存在Z-VAD-fmk（Z-VAD）或STS（15小时）的情况下培养24小时然后再培养DiOC6（3） 或PI染色(x个±扫描电镜；n个= 4). *,P（P）与CM值相比<0.05；§,P（P）与NF值相比<0.05。
图9：。
图9：。
的目标Atg公司基因增强了营养物质消耗的致命性。（A） mRNA水平降低Atg公司-特异性siRNA。用指定的siRNA处理后，24小时后通过定量RT-PCR测定mRNA水平。结果(x个±扫描电镜；n个=3）表示为百分比，100%被认为是未经处理的对照细胞的mRNA水平。（B） 的影响Atg公司-如图3B所示，测定线粒体和溶酶体共定位的特异siRNA。（C和D）凋亡抑制可减少饥饿和Atg耗竭引起的细胞死亡。用不同的siRNA构建物处理具有指定基因型的细胞（C组为野生型；D组为Neo、Bcl-2或vMIA）（24小时），然后饥饿营养和/或用Z-VAD-fmk（Z-VAD）或STS处理。DiOC细胞荧光分析的数据结果6（3） -或PI染色细胞(x个±扫描电镜；n个= 4). *,P（P）与CM的值相比<0.05；§,P（P）与NF值相比<0.05。
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