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.2005年3月；16(3):1555-67.
doi:10.1091/mbc.e04-07-0594。 Epub 2005年1月12日。

高尔基体碎裂与神经酰胺诱导的细胞效应有关

魏虎 1, 徐瑞娟, 张国峰, 金俊飞, Zdzislaw M Szulc公司, 杰克·比拉夫斯基, 优素福·A·汉农, 丽娜·M·奥贝德, Cungui Mao公司
附属公司

高尔基体碎裂与神经酰胺诱导的细胞效应有关

魏虎等。 分子生物学细胞. 2005年3月.

摘要

神经酰胺已被证明可引起失巢凋亡，失巢凋亡是一种因细胞粘附不足而引起的细胞凋亡亚型。然而，根本机制尚不清楚。在此，我们报道了D-e-C6陶瓷（D-e-Cer）通过产生鞘氨醇，破坏高尔基复合体（GC），该复合体与包括失巢蛋白在内的各种细胞效应相关。用D-e-Cr处理HeLa细胞导致细胞在凋亡前伸长、扩散抑制、变圆和脱离（失巢）。在D-e-Cer处理的细胞中，GC中β1整合素的糖基化被抑制，因此其相关的整合素受体无法转移到细胞表面。神经酰胺治疗也抑制微管和F-actin细胞骨架、局部粘连和丝状体的重组。在这些细胞效应之前，高尔基复合体破碎。相反，D-e-Cer的对映体L-e-C6陶瓷（L-e-Cer）未能诱导这些细胞效应。质谱分析表明，用D-e-Cer而非L-e-Cer处理HeLa细胞，可使神经酰胺水解产物鞘氨醇的水平增加50倍以上。用D-e-鞘氨醇及其对映体L-e-鞘磷脂进行处理，导致大量核周空泡化、高尔基体碎裂和细胞圆形。总之，这些结果表明，神经酰胺水解产生的鞘氨醇会导致GC中断，导致各种细胞效应。

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数字

图1。
图1。
（A） 神经酰胺处理导致HeLa细胞生长停滞和形态改变。在含有10%FBS的MEM培养基中，HeLa细胞生长到60%的汇合处，用不同浓度的D-e-Cer或L-e-Cer处理24 h，并进行MTT分析以确定活细胞数。（B） 在配备CCD相机（Dage MTI 330T-RC）的倒置显微镜（Nikon Eclipse TE200）下，在存在或不存在50μM Z-VAD-fmk的情况下，用2.5μM D-e-Cer、10μM L-e-Cer，10μM D-t-Cer或乙醇（Et）处理HeLa细胞12 h。数据表示重复进行的三个不同实验的平均值±SD。这个数字代表了至少三个独立的实验。
图2。
图2。
神经酰胺诱导的HeLa细胞形态变化与凋亡无关。用载体（Et）或2.5μM D-e-Cer（Cer）处理HeLa细胞12 h后，用Hoeschst 33342（A）、PARP裂解的Western blot分析（B）和FACS分析（C）进行核染色。这些数字表示细胞周期S期（S）细胞或凋亡细胞（A）在总细胞群中的百分比。这个数字代表了至少三个独立的实验。
图3。
图3。
长期使用神经酰胺治疗会导致生长停滞和细胞凋亡。用2.5μM D-e-Cer或Et处理的HeLa细胞在24、36和48 h（A）进行FACS分析，36 h（B）进行annexin-V罗丹明染色和显微镜分析，PARP裂解的Western blot分析（C），以及36 h（p85）PARP的85-kDa裂解片段caspase 9和3活化的Westernblot分析；案例。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9；和案例。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。这个数字代表了至少三个独立的实验。
图4。
图4。
神经酰胺抑制整合素介导的细胞粘附到细胞外基质并在其上扩散。如图1所示，将相同数量的HeLa细胞用D-e-Cer（2.5μM）或载体对照处理16 h后，将其置于涂有纤维连接蛋白（10μg/ml）和层粘连蛋白（20μg/ml，粘附细胞的数量按照以下所述进行测定材料和方法（B）通过显微镜分析评估细胞形态。数据表示重复进行的三个独立实验的平均值±SD。这个数字代表了至少三个独立的实验。
图5。
图5。
D-e-Cer治疗抑制GC中β1整合素的糖基化及其相关整合素受体向细胞表面的转运。用2.5μM D-e-Cer（Cer）或Et处理16 h的（A和B）HeLa细胞进行裂解，并使用α5、α6和β1整合素亚基抗体对细胞裂解产物进行Western blot分析。（C） 上述细胞裂解物在Western blot分析前用PGNase F处理。（D） 在Western blot分析之前，HeLa细胞也在MNJ（200μg/ml）存在下用D-e-Cer或Et处理过夜。（E） 用5μM D-E-Cer或Et处理HT1080细胞，并用抗β1整合素抗体进行Western blot分析。用D-e-Cer或Et处理16 h的HeLa细胞被生物素化。用链霉亲和素琼脂糖珠沉淀总生物素化细胞表面蛋白，并用β1、α5或α6整合素亚基（F）抗体进行Western blot分析。（G） 对上述细胞的裂解产物进行体外纤维连接蛋白结合试验，如下所述材料和方法上述数据代表了至少三个实验的结果。Mat.，成熟；之前。，前辈。这个数字代表了至少三个独立的实验。
图6。
图6。
D-e-乙酰胺处理导致高尔基复合体碎裂，并抑制蛋白质从内质网中流出。（A）在共聚焦显微镜分析之前，用D-e-Cer或Et处理不同时间段的HeLa细胞与抗GM130和p230-Trans抗体共标记。（B） 用0.4U/ml bMase或载体（甘油）处理两小时后，用抗巨蛋白抗体对HeLa细胞进行染色，并通过共聚焦显微镜进行分析。（C） 用D-e-Cer或Et治疗16小时后，用相应的抗体通过Western blot分析测定giantin、GM130和p230-Trans的表达。（D） 用Et或2.5μM D-e-Cer处理HeLa细胞1h后，将其固定并进行电子显微镜分析。g、 高尔基复合体；n、 核心。（E） 注意，在D-E-Cer处理的细胞中，液泡的形成与高尔基复合体的部分破裂密切相关。用D-e-Cer（2.5μM）或Et处理HeLa细胞4小时，然后分别与抗姜黄素和细胞色素C（Cyto C）的抗体共免疫。（F） 质粒pEYFP-Golgi和pDsRed2-ER转染12小时后，用D-e-Cer或载体处理HeLa细胞6小时。活细胞在共焦显微镜下成像。该图代表了多个独立实验。
图7。
图7。
神经酰胺改变微管和F-actin细胞骨架的排列，并抑制局灶性粘连和丝状体的形成。在用2.5μM D-e-Cer或Et处理不同时间后，HeLa细胞在共聚焦显微镜分析前用抗α-微管蛋白（红色）和栀子苷（绿色）（A）、指骨苷-罗丹明（红色）、栀子苷-绿色（B）或帕罗西林（C）的抗体染色。请注意，经载体处理的细胞含有丰富的丝状伪足，在神经酰胺处理的细胞中显著减少。（D） 质粒pEYFP-Mem直接靶向质膜表达增强型黄色荧光蛋白（EYFP），转染24小时后，对HeLa细胞进行D-e-Cer或载体对照处理12小时，然后进行共聚焦显微镜分析。注意，D-e-Cer处理的细胞中的丝状伪足被显著抑制。这个数字代表了至少三个独立的实验。
图8。
图8。
布雷费尔丁A的作用与神经酰胺治疗类似。（A） 用二甲基亚砜（DMSO）或100 nM BFA处理HeLa细胞8小时，并在倒置显微镜下拍照。共聚焦显微镜前，将这些细胞固定并用抗栀子苷（绿色）和指骨苷-罗丹明（红色）（B）共同染色或用抗帕希林抗体（C）染色。用二甲基亚砜或BFA处理HeLa细胞不同时间后，进行FACS分析（D）。G1、G1相、G2、G2相、S、S相；A、 细胞凋亡。这个数字代表了至少三个独立的实验。
图9。
图9。
神经酰胺水解产生的鞘氨醇可能通过空泡化导致GC裂解。HeLa细胞与二甲基亚砜（DMSO）或Z-VAD-fmk（50μM）预孵育1h，然后向培养基中添加Et或2.5μM D-e-Cer。（B） 16小时后，在共聚焦显微镜（A）前，将细胞固定并用抗栀子素抗体进行免疫染色。与2.5μM NBD-C孵育30分钟后6-cer、HeLa细胞在共聚焦显微镜下固定并用抗巨蛋白抗体标记。（C） 用Et或10μM L-e-C处理HeLa细胞6-神经酰胺（L-e-Cer）16小时后，用金雀花碱和共焦显微镜进行免疫染色。（D） 神经酰胺的代谢。C6-Glu-Cer，C型6-葡糖神经酰胺；CDase、神经酰胺酶；葡萄糖神经酰胺合成酶；SM，鞘磷脂。（E） 用Et，20μM D-E-C处理HeLa细胞6-SM或20μM D-e-C8-Glu-Cer 16小时，2.5μM D-e-鞘氨醇（D-e-Sph）、2.5μM L-e-鞘磷脂（L-e-Sph）或2.5μM D-e-Cer 4小时，然后用抗-giantin抗体和共焦显微镜进行免疫染色。（F） 用Et或2.5μM L-e-Sph处理HeLa细胞1h或6h后，在倒置显微镜下固定并拍照。注意，用L-e-sph处理1h的细胞出现大量的核周空泡，6h内细胞全部变圆。上述用Et或L-e-sph处理1h后的细胞在共焦显微镜（G）前用抗LAMP1抗体染色。注意，抗LAMP1染色阳性的核周液泡表明溶酶体起源。这个数字代表了至少三个独立的实验。
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