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.2004年11月1日；18(21):2627-38.
doi:10.1101/gad.1241904。

Polycomb Ezh2甲基转移酶调节肌肉基因表达和骨骼肌分化

朱塞皮娜·卡雷蒂 1, 莫妮卡·迪·帕多瓦, 布鲁斯·迈克尔斯, 加里·莱昂斯, 维托里奥·萨托雷利
附属公司

多梳Ezh2甲基转移酶调节肌肉基因表达和骨骼肌分化

朱塞皮娜·卡雷蒂等。 基因开发. .

勘误表in

  • 基因开发，2005年3月15日；19(6):768

摘要

Ezh2蛋白赋予Polycomb PRC2和PRC3复合物与转录抑制相关的组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HKMT）活性。我们报道，Ezh2的表达在小鼠体节的肌节室中受到发育调控，其下调与肌肉基因表达的激活和卫星细胞衍生成肌细胞的分化一致。Ezh2表达增加抑制肌肉分化，这一特性是由其SET结构域赋予的，是HKMT活性所必需的。在未分化成肌细胞中，内源性Ezh2与转录调节因子YY1相关。使用脱乙酰酶HDAC1在沉默肌肉特异性基因的基因组区域检测到Ezh2和YY1。它们的存在与组蛋白H3的K27甲基化有关。YY1是Ezh2结合所必需的，因为YY1的RNA干扰消除了Ezh2的染色质募集并阻止了H3-K27甲基化。基因激活后，Ezh2、HDAC1和YY1从肌肉位点分离，H3-K27发生低甲基化，MyoD和SRF被招募到染色质中。这些发现表明，存在一种两步激活机制，即需要去除H3-K27甲基化，由活性的含Ezh2的蛋白质复合物赋予，然后在离散的基因组位点募集阳性转录调节因子，以促进肌肉基因表达和细胞分化。

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数字

图1。
图1。
Ezh2早期在发育体节的肌细胞室和未分化的骨骼肌成肌细胞中表达。(A类)肌生成素(左边面板）和Ezh2(正确的在E9.5、E11.5和E15.5小鼠胚胎的切片上通过原位RNA杂交分析转录物。在E9.5的矢状切面上，在发育体节的肌节中检测到肌生成素mRNA。（nt）神经管；（t） 尾部；（v）耳囊；（ba）鳃弓；（h） 心脏。Ezh2 mRNA在所有结构中均高水平检测到。在E11.5的横截面中，在发育中的肌体（myo；箭头）中检测到肌生成素，在肢芽（lb）中检测到低水平的肌生成素。（li）肝脏；（h） 心脏；（nt）神经管。在E11.5，Ezh2 mRNA水平从E9.5显著下降。Ezh2在神经管、肝脏、肢芽和近轴中胚层中检测到。在E15.5下颌（j）水平的横切面上，在舌（对）肌、肩部肌肉（shm）、胸肌（pm）和所有其他骨骼肌中检测到肌生成素mRNA。（sg）唾液腺。在E15.5，Ezh2 mRNA仅在胸腺（th）中检测到。(B类)小鼠原代肌肉卫星细胞在生长条件（P，增殖）下培养，或在融合后诱导分化0、24和48小时。分离RNA，并用Ezh2、MCK和GAPDH的特异性引物进行RT-PCR。(C类)用Pax7、MHC和微管蛋白抗体在不同分化阶段对肌肉卫星细胞提取物进行免疫印迹。(天)对C2C12增殖成肌细胞（MB）和分化肌管（MT）进行Ezh2免疫染色，并用DAPI显示细胞核。(电子)对处于不同分化阶段（分化培养基中的12、36和48 h）的增殖成肌细胞（MB）和成肌细胞的核质提取物进行分离，并对Ezh2和微管蛋白进行免疫印迹。
图2。
图2。
Ezh2的SET结构域是抑制肌肉基因表达和分化所必需的。(A类)对转染MCK-luc报告子和MyoD、Ezh2和Ezh2ΔSET突变表达载体的NIH 3T3成纤维细胞进行荧光素酶分析，并在分化培养基中培养48h(B类)用对照、Ezh2野生型或Ezh2ΔSET突变逆转录病毒转导C2C12成肌细胞，诱导分化36h后进行MHC免疫染色。DAPI显示细胞核。(C类)用对照、Ezh2野生型或Ezh2ΔSET突变逆转录病毒转导小鼠原代肌肉卫星细胞，诱导分化36 h，并对MHC进行免疫染色。DAPI显示细胞核。(天)用MHC、肌生成素、微管蛋白和myc（检测myc标记的Ezh2和Ezh2ΔSET突变蛋白）对不同分化阶段（在生长介质[0]中汇合；在分化介质中12、24、36 h）转导的成肌细胞提取物进行免疫印迹抗体。中使用的单元格B类和天属于相同的多克隆并且已经在相同的实验中培养。
图3。
图3。
Ezh2存在于两个转录不活跃的肌肉基因的染色质调节区，在基因激活时不再检测到。(A、 B类)用Ezh2抗体或对照IgG对来自未分化成肌细胞（MB）或分化肌管（MT）的染色质进行ChIP。沉淀的DNA片段用跨越MHCIIb启动子指示调控区域的特定寡核苷酸进行扩增(A类)，MCK增强子(B类)或肌生成素启动子(天)通过实时PCR。(C类)通过RT-PCR分析检测成肌细胞（MB）或肌管（MT）中MHCIIb、MCK和GAPDH的转录。(E、 F类)带有MyoD抗体或MHCIIb启动子肌母细胞（B）或肌管（T）染色质上控制IgG的ChIP(电子)和MCK增强子(F类). (G公司)将Ezh2、HDAC1和MyoD表达载体以不同组合转染293T细胞。制备细胞提取物，并用抗myc抗体进行免疫沉淀，用抗Flag抗体显示沉淀的蛋白质。非特异性IgG作为对照。
图4。
图4。
Ezh2、HDAC1和YY1占据转录不活跃肌肉调节区的染色质，而MyoD和SRF参与基因激活。(A类)用YY1抗体或对照IgG免疫沉淀未分化成肌细胞或分化肌管的细胞提取物，并用Ezh2抗体免疫印迹沉淀物质。(B类-天)从成肌细胞获得的染色质上带有Ezh2、HDAC1、YY1和SRF抗体的ChIP。对照组为无输入DNA（无DNA）或ChIP与非特异性IgG的反应。用MHCIIb启动子引物PCR扩增沉淀DNA(B类)，MCK增强子(C类)，或淀粉酶启动子(天). (E、 F类)按照中所述执行ChIPB类和C类使用来自成肌细胞或肌管的染色质。沉淀的DNA通过实时PCR用MHCIIb启动子的特异性引物进行扩增(电子)或MCK增强子(F类). (G公司-我)按照中所述执行ChIPB类-天但染色质是从分化的肌管中获得的。(J型)通过RT-PCR分析检测成肌细胞（MB）或肌管（MT）中MHCIIb、MCK和GAPDH的转录。(K（K）)用Ezh2、YY1、SRF和Sp1抗体检测不同分化阶段成肌细胞提取物的免疫印迹。
图5。
图5。
未分化成肌细胞和分化肌管中肌肉调节区的H3-K27甲基化。(A、 B类)ChIP与来自成肌细胞或肌管的染色质上的对照IgG、Ezh2、H3-K27α-三甲基化（3m）和α-二甲基化（2m）抗体。使用MHCIIb启动子的特异性引物通过实时PCR扩增沉淀的DNA(A类)或MCK增强子(B类). (C类)ChIP含有对照IgG或抗乙酰化H4抗体，其染色质来自MCK增强子上的成肌细胞（B）或肌管（T）。(天)按照中所述执行ChIPA类和B类使用MCK启动子而非增强子的特异性引物。(电子)按照中所述执行ChIPA类和B类使用肌生成素启动子的特异性引物。
图6。
图6。
Ezh2和H3-K27甲基化的高效染色质补充需要YY1的存在。(A类)用对照（FITC标记的siRNA；见材料和方法）或YY1特异性siRNA转染骨骼成肌细胞，并用YY1、Ezh2和微管蛋白抗体对其提取物进行免疫印迹。(B类)使用对照IgG或三甲基、二甲基H3-K27、YY1和Ezh2抗体对从转染对照或YY1 siRNA的细胞中获得的染色质进行ChIP分析。使用MHCIIb启动子和MKC增强子特异性引物通过PCR分析免疫沉淀染色质。显示了总输入的三种稀释。通过用NIH Image软件扫描单个条带的强度，并将siRNA对照条带获得的值除以相应siRNA YY1条带获得的值，来进行染色质结合减少的定量。根据两个输入DNA的比率校正每个值（输入DNA siRNA控制/输入siRNA YY1）。(C类)用对照或Ezh2特异性siRNA转染骨骼肌成肌细胞，并用Ezh2、YY1和微管蛋白抗体对其提取物进行免疫印迹。(天)用对照IgG和三甲基、二甲基H3-K27、YY1和Ezh2抗体对转染对照或Ezh2 siRNA的细胞的染色质进行ChIP分析。免疫沉淀染色质用MHCIIb启动子和MCK增强子特异性引物进行PCR分析。定量按中所述进行B类每个值都根据两个输入DNA的比率进行了校正（输入DNA siRNA控制/输入siRNA Ezh2）。
图7。
图7。
肌肉基因表达的两步激活模型。某些肌肉特异性基因的调控区域被含有DNA-结合蛋白YY1、甲基转移酶Ezh2和脱乙酰酶HDAC1的蛋白质复合物占据。HDAC1对赖氨酸残基的脱乙酰化和Ezh2对H3-K27的二/三甲基化积极阻止转录（抑制状态）。在转录激活开始时，YY1从染色质中移位，随后丢失Ezh2和HDAC1，并被SRF取代。H3-K27发生低甲基化，MyoD转录因子家族的负载允许组蛋白乙酰转移酶（HAT）的参与，并允许转录的启动（激活状态）。
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