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.2004年9月13日；166(6):801-13.
doi:10.1083/jcb.200405128。

在Chk1介导的途径中BLM解旋酶与53BP1在S期阻滞中的功能相互作用

萨加尔·森古普塔 1, 安娜·I·罗伯斯, 史蒂文·林奇, 娜塔莎一世Sinogeeva, 冉·张, 雷米·佩德乌克斯, 艾琳·M·沃德, 阿尔卡迪·塞莱斯特, 安德烈·努森茨威格, 陈俊杰, Thanos D Halazonetis公司, 柯蒂斯·C·哈里斯
附属公司

在Chk1介导的途径中BLM解旋酶与53BP1在S期阻滞中的功能相互作用

萨加尔·森古普塔等。 J细胞生物学. .

摘要

布鲁姆综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传病，其特征是染色体畸变、遗传不稳定性和癌症易感性，所有这些都可能是DNA损伤识别过程中异常信号转导的结果。在这里，我们表明BLM是对停滞的DNA复制叉的中间反应器。BLM与DNA损伤反应蛋白53BP1和H2AX共定位并物理相互作用。虽然BLM促进了p53和53BP1之间的物理相互作用，但53BP1是BLM和p53在复制停滞部位有效积累所必需的。BLM/53BP1病灶的积累及其物理相互作用与γ-H2AX无关。活性的Chk1激酶对于53BP1与BLM的精确共定位以及BLM的稳定至关重要。一旦收到来自复制应激的ATR/Chk1和53BP1介导的信号，BLM就会在多个下游修复过程中发挥作用，从而发挥其作为看守性肿瘤抑制物的作用。

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数字

图1。
图1。
γ-H2AX、53BP1、BLM和p53以类似的动力学共定位和累积。（A） HU治疗后BrdU、γ-H2AX、53BP1、BLM和p53病灶积聚的时间进程。NHF受到接触抑制，在低稀释度下分裂，并在指定的时间间隔内用HU处理。在清洗的细胞上进行BrdU染色，并与核苷酸类似物孵育10分钟。用BrdU/γ-H2AX（a）抗体进行免疫荧光；53BP1（单克隆）/γ-H2AX（b）；53BP1（单克隆）/BLM（ab476）（c）；和53BP1（单克隆）/p53（CM1）（d）。棒材，5μm。（B） A的定量。图表表示平均值±标准偏差。（C）HU治疗后蛋白质的积累。用抗γ-H2AX（a）、抗53BP1（多克隆；b）、抗BLM（C-18）（C）、抗p53（DO-1）（d）和抗TBP抗体（e）进行蛋白质印迹。
图2。
图2。
53BP1通过BLM与p53相互作用。（A和C）BLM免疫沉淀显示NHF和NHF E6中有53BP1。NHF（A）和NHF E6（C）要么不同步（泳道1），要么接触抑制，在低稀释下分裂，并用HU（泳道2）处理6小时。在不存在（泳道3和4）或存在（泳道5）阻断肽的情况下，用抗BLM（C-18）的抗体免疫沉淀400μg裂解物。输入（通道1和2）表明10%的裂解液用于免疫沉淀。免疫沉淀的效率通过自身抗体（a）进行验证。用抗53BP1（多克隆；针对A和C，b）和抗p53（DO-1）（仅针对A，C）抗体检测BLM免疫沉淀物。车道1和3，减去HU；第2、4和5道，加上HU。（B和D）p53的免疫沉淀显示NHF中有53BP1，但BS中没有。与A和C中相同，但B和D中使用了NHF，BS中使用了D。免疫沉淀是使用针对p53（DO-1）（第3和4道）或对应IgG（第5道）的抗体进行的。用多克隆抗53BP1抗体（b）检测p53免疫沉淀物。（E） γ-H2AX、53BP1和BLM在缺乏p53的情况下共定位。如A中所述制备NHF或NHF E6，并用HU处理6 h。用抗γ-H2AX/53BP1（单克隆；A）和BLM（ab476）/53BPl（单克隆）抗体进行免疫荧光。棒材，5μm。（F） 即使在没有BLM的情况下，53BP1也会在暂停复制分支的站点上累积。与E中相同，但使用了BS和BS A-15细胞。棒材，5μm。
图3。
图3。
53BP1调节BLM的积累。（A） 53BP1的缺失导致KO MEF中BLM的核仁积累。用HU处理WT或53BP1 KO MEF 6 h。用BLM（ab476）/53BP1（单克隆；a）抗体进行免疫荧光；p53（CM1）/53BP1（单克隆；b）；和BLM（ab476）/核仁蛋白（c）。（B） 在53BP1siRNA处理的细胞中，BLM与53BP1和p53的相互作用降低。对照组（第1和第2道）或53BP1 siRNA-转染组（第3和第4道）NHF受到接触抑制，在低稀释度下分裂，并在无HU（第1道和第3道）或无HU的情况下（第2和第4车道）生长6小时。在无HU的情况下，用BLM（C-18）（第5-9道）抗体免疫沉淀400μg裂解物（第5-8道）或阻断肽的存在（通道9）。输入（通道1-4）表明10%的裂解液用于免疫沉淀。用BLM（ab476）抗体（a）验证免疫沉淀的效率。用于检测BLM免疫沉淀中其他蛋白的抗体是抗53BP1（多克隆；b和d）和抗p53（DO-1）（c和e）。车道1、3、5和7，减去HU；通道2、4、6、8和9，加上HU。面板d和e是b和c中相同斑点的较长曝光时间。（c）缺乏53BP1阻止BLM和p53的积累。如B所示进行转染和治疗。使用BLM（ab476）/53BP1（单克隆）/DNA（DAPI）（a）和p53（CM1）/53BP 1（单抗）/DNA的抗体进行免疫荧光。选择包含53BP1表达未被抑制的细胞的字段作为缺乏53BP1的细胞的内部控制。箭头指示缺少53BP1表达的细胞的位置。（D） C的定量。直方图表示平均值±标准偏差。
图4。
图4。
53BP1和BLM可以独立于γ-H2AX进行积累和物理相互作用。（A） HU后WT和H2AX KO MEF中蛋白质的积累。H2AX WT（1和2道）和KO（3和4道）细胞接触受到抑制，低稀释分裂，并在没有HU（1和3道）或存在HU（2和4道，抗γ-H2AX（c）和抗TBP抗体（d）。（B） 即使在没有γ-H2AX的情况下，53BP1和BLM也会在停滞复制叉的位点积累。MEF按A处理。用抗γ-H2AX/53BP1（单克隆；A）和BLM（ab476）/53BPl（单克隆）抗体进行免疫荧光。棒材，5μm。（C） B的定量。直方图表示平均值±标准差。（D）BLM与53BP1和BLM相互作用，即使在没有H2AX的情况下。WT（第1和第2道）或H2AX KO（第3和第4道）MEF按照A中的方法制备，然后未经处理（第1道和第3道）或用HU（第2和第4车道）处理6小时。用BLM抗体（ab476）（第5-8道）或相应的IgG抗体（第9道）免疫沉淀400μg裂解物。输入（通道1-4）表示10%的裂解液用于免疫沉淀。用BLM（ab476）抗体（a）验证免疫沉淀的效率。在BLM免疫沉淀中用于检测其他蛋白质的抗体是抗53BP1（多克隆）（b）和γ-H2AX（c）。车道1、3、5、7，减去HU；车道2、4、6、8和9，加上HU。
图5。
图5。
53BP1和BLM的积累取决于Chk1和ATR的存在。（A） 对照组和Chk1 siRNA-处理的NHF中蛋白质的积累。对照组（通道1和2）或Chk1 siRNA-转染的NHF（通道3和4）受到接触抑制，在低稀释度下分裂，并在没有HU（通道1、3）或存在HU（路径2和4）的情况下生长6小时。用抗Chk1（a）、抗pChkl（b）、抗53BP1（多克隆；c）、抗BLM（c-18）（d）和抗TBP抗体（e）进行免疫印迹（B）缺乏Chk1可阻止pChk1、BLM和p53的积累。NHFs转染和处理如A所示。使用BLM（C-18）/pChk1/DNA（DAPI）（A）和53BP1（单克隆）/pChk 1/DNA（DAPI）（b）抗体进行免疫荧光。选择包含Chk1表达未被抑制的细胞的字段作为缺乏Chk1的细胞的内部控制。箭头指示缺少Chk1表达的细胞的位置。棒材，5μm。（C） 图5（B、E和G）的量化。直方图表示平均值±标准差。（D）因UCN-01处理和Chk1野生型（WT）或反义（AS）转染而导致NHF中蛋白质的积累。转染Chk1 WT（第3车道）或AS（第4车道）的NHF受到接触抑制，在低稀释度下分裂，并且未经处理（第1车道）或用HU处理（第2-4车道）。未转染HU处理的细胞与UCN-01（第5通道）共培养。用抗Chk1（a）、抗pChk1、抗BLM（C-18）（C）、抗53BP1（多克隆；d）和抗TBP抗体（e）进行蛋白质印迹。（E） UCN-01抑制BLM/53BP1与pChk1的局部共定位。在D中制备NHF，并用HU（a）或HU和UCN-01（b）处理6 h。用抗pChk1/BLM（C-18）或53BP1（单克隆）/BLM（ab476）的抗体进行免疫荧光。（F） 用咖啡因和LY294002处理后NHFs中蛋白质的积累。NHF被接触抑制，在低稀释度下分离，未经处理（第1道）或用HU处理（第2-4道）。用咖啡因（第3道）或LY294002（第4道）混合。用抗pChk1（a）、抗53BP1（多克隆；b）、抗BLM（C-18）（C）和抗TBP（d）抗体进行蛋白质印迹。棒材，5μm。（G） 咖啡因和LY294002抑制53BP1和BLM的局部共定位。NHF按F制备，并用HU（a）处理；HU和咖啡因（b）；用抗pChk1/BLM（c-18）或53BP1（单克隆）/BLM（ab476）的抗体进行免疫荧光。棒材，5μm。
图6。
图6。
Chk1介导的BLM磷酸化。（A） Chk1磷酸化p53和BLM。重组Chk1（WT或KD）与全长p53或BLM蛋白在γ-32P ATP。蛋白质经SDS-PAGE分离，放射自显影检测。（B） Chk1磷酸化BLM T99A/T122A突变体。除使用免疫沉淀WT-BLM或T99A/T122A突变体外，磷酸化反应与A中相同。（C） Chk1和BLM在体内相互作用。NHF受到接触抑制，在低稀释度下分裂，并用HU处理6 h。用BLM抗体（ab476）（3和4道）、Chk1抗体（6和7道）或相应的山羊IgG抗体（5道，山羊；8道，兔子）免疫沉淀裂解液（2 mg）。输入（通道1和2）表明5%的裂解液用于免疫沉淀。用BLM（ab476）（a）和Chk1（b）抗体检测印迹。车道1、3、6，减去HU；通道2、4、5、7和8，加上HU。（D）抑制Chk1介导的磷酸化使BLM不稳定。NHF要么未经治疗（车道1），要么接受HU（车道2）、LLnL（车道3）、HU+UCN-01（车道4）和HU+UN-01+LLnL治疗（车道5）。用抗BLM（C-18）（a）和抗TBP（b）抗体进行蛋白质印迹。（E） Chk1介导体内BLM对丝氨酸残基的磷酸化。NHF按D处理（对于a和b）或在含有2 mCi的无磷二甲醚存在下生长32每毫升P标记的无机磷酸盐（对于c）。用BLM抗体（ab476）（1-5道）或相应的IgG抗体（6道）免疫沉淀裂解液（2 mg）。用（a）BLM（ab476）抗体验证免疫沉淀的效率。用磷酸丝氨酸抗体（b）或放射自显影术（c）检测BLM上的磷酸化。
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