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.2004年8月3日；101(31):11269-74.
doi:10.1073/pnas.0400541101。 Epub 2004年7月26日。

涉及上游ORF的再激活调节哺乳动物细胞中ATF4 mRNA的翻译

克里希纳·M·瓦蒂姆 1, 罗纳德·C·韦克
附属公司

涉及上游ORF的再激活调节哺乳动物细胞中ATF4 mRNA的翻译

克里希纳·M·瓦特姆等。 美国国家科学院程序. .

摘要

在细胞应激期间，真核细胞起始因子-2（eIF2）的磷酸化可诱导旨在改善潜在细胞扰动的基因表达。这种应激反应的核心是转录调节物激活转录因子ATF4。在这里，我们描述了调节ATF4表达的机制，涉及小鼠ATF4 mRNA 5'前导中两个上游ORF（uORF）的差异贡献。5'近端uORF1是一种积极作用的元件，有助于ATF4 mRNA下游编码区的核糖体扫描和重新启动。当eIF2-GTP在非应激细胞中大量存在时，uORF1下游的核糖体在下一个编码区uORF2重新启动，该编码区是一种阻止ATF4表达的抑制元件。在应激条件下，eIF2的磷酸化和eIF2-GTP水平的相应降低增加了扫描核糖体重新启动翻译所需的时间。这种延迟的再启动允许核糖体扫描抑制性uORF2，而不是在ATF4编码区重新启动。ATF4的表达增加将有助于细胞应激损伤修复相关基因的表达。这些结果表明，涉及uORF的翻译再启动机制从酵母到哺乳动物是保守的。

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数字

图1。
图1。
的非编码部分中的两个uORF自动变速箱4mRNA在脊椎动物中是保守的。(A上部)利用经Tg或无应激处理的S/S MEF细胞制备的RNA，通过5′RACE获得DNA。DNA样品在2%琼脂糖凝胶中通过电泳分离。ATF4表示通过使用内源性自动变速箱4mRNA和ATF4-Luc表示来自自动变速箱4-吕克抄本。碱基对中的尺寸标记显示在右侧。(A下部)领导者的顺序自动变速箱4mRNA。A类欣dIII限制性位点被设计成自动变速箱4DNA。的主要转录起始点自动变速箱4该基因由5′RACE产物测序确定，并用箭头表示。该转录起始位点上游的ATF4序列可能有助于ATF4转录，如潜在的TATAA框（下划线）所示。方框表示位于自动变速箱4-编码区域。uORF1编码一种3-氨基酸残基多肽，位于uORF2上游87 nt。uORF2，长度180 nt，与自动变速箱4-编码区域，它匹配uORF2和自动变速箱4-吕克记者。uORF1和uORF2起始密码子中的突变导致ATF4翻译控制的每个无功能，如下序列所示。三种不同的茎环结构和120-bp的插入分别在精神分裂症限制站点位于uORF 1和uORF 2之间。值得注意的是，一个额外的小ORF存在于主要转录起始位点的5′。一个含有该uORF的ATG突变的报告构建物的ATF4-luciferase活性是在类似于WT的压力下诱导的自动变速箱4-吕克（未显示数据），支持该区域不存在于自动变速箱4mRNA。(B)GenBank（登录号）中编码ATF4相关序列的代表性cDNA，包括人类（BC008090）、小鼠（AK003001）、大鼠（CK601272）、奶牛（CK960046）、鸡（AB013138）和斑马鱼（CA470055），揭示了具有与小鼠类似的双uORF结构的mRNA自动变速箱4。每个面板都按比例绘制。深色方框表示两个uORF。覆盖uORF2的打开的白色框是ATF4编码区域。uORF1和2之间以及uORF2开始和重叠ATF4编码区开始之间的核苷酸数量显示在每个面板的顶部。每个面板下面提到的数字代表每个uORF编码的氨基酸数量。
图5。
图5。
ATF4平移控制的先导序列模型。这个自动变速箱4mRNA显示为一条直线，其中uORF 1和uORF 2显示为方框。小核糖体亚单位的阴影表明其与eIF2-GTP结合公式图像在积极作用的uORF1翻译后，核糖体保留在下游ORF重新启动翻译的能力。目前，这种再启动能力的基础尚不明确。在相关的GCN4型翻译机制，类似uORF1的终止上下文被认为有助于小核糖体亚基与GCN4号机组信使核糖核酸（1，12，28）。翻译后自动变速箱4uORF1，40S核糖体亚基被提议沿5′至3′方向恢复扫描自动变速箱4成绩单。当eIF2-GTP绑定时公式图像在非应激条件下大量存在，小核糖体亚基迅速获得eIF2三元复合物，并与60S核糖体结合，在uORF2重新启动翻译。在这种抑制性uORF2翻译后，核糖体从自动变速箱4mRNA，从而减少自动变速箱4-编码区域。当细胞受到内质网应激或营养剥夺时，eIF2磷酸化水平增强，导致eIF2-GTP水平降低。翻译uORF1后，重新获取耦合eIF2-GTP所需的时间增加公式图像它允许扫描40S核糖体亚单位的一部分扫描阴性uORF2。从uORF2开始扫描mRNA-leader区域到自动变速箱4-编码区，核糖体重新获得eIF2三元复合物，促进自动变速箱4当uORF1突变时，核糖体从自动变速箱4mRNA将在uORF2启动翻译。在抑制性uORF2翻译后，核糖体从自动变速箱4mRNA，从而降低自动变速箱4-编码区，即使eIF2-GTP水平因细胞应激而降低。与WT相比，当uORF1和uORF2之间的距离增加时，大多数核糖体在到达uORF2s之前能够重新启动，从而减少自动变速箱4独立于eIF2 GTP可用性的翻译。
图2。
图2。
eIF2的磷酸化是必需的自动变速箱4翻译表达。(上部)用1.0μM Tg处理WT（S/S）或突变MEF细胞，其中含有eIF2α，Ala取代Ser-51（A/A），处理时间为指定的小时数，或无应激（0），并使用特异识别Ser-51磷酸化eIF2 A的抗体通过免疫印迹测量eIF2的磷酸化。使用识别eIF2α磷酸化和非磷酸化形式的抗体，对eIF2总α进行类似分析。(下部)中的uORF自动变速箱4-吕克报告结构以标有1或2的框表示（不按比例）。S/S和A/A MEF细胞与自动变速箱4-吕克质粒和a雷尼利亚作为标准化的内部对照的萤光素酶质粒。随后用指示浓度的Tg或无ER应激剂（0μM）处理转染细胞6小时。相对光单位（RLU）是归一化的萤火虫荧光素单位比率雷尼利亚荧光素酶单位，每个值来自三个独立的转染。白色条代表从无应力MEF单元获得的值，灰色条代表从内质网应力单元获得的数值。
图3。
图3。
的级别自动变速箱4-吕克mRNA在非应激和内质网应激MEF细胞之间相似。从表达WT的S/S和A/A MEF细胞中制备总RNA自动变速箱4-吕克或uORF1或uORF2中有缺陷的突变型，如图所示。用凝胶电泳分离等量的总RNA，用溴化乙锭染色显示18S和28S rRNA(中部). 然后将RNA转移到膜过滤器自动变速箱油-吕克通过使用与荧光素酶报告基因互补的放射性标记探针和放射自显影术测量转录物(顶部). Northern blot分析也通过使用放射性标记的肌动蛋白探针进行，以确保类似数量RNA的特征(底部). ΔG=–41 kcal/mol的杆环或120-bp的插入物包含在自动变速箱4-吕克报告者构造如图所示。
图4。
图4。
uORF1作为一个阳性调节器发挥作用，而uORF2在调节翻译的扫描机制中是抑制性的自动变速箱4mRNA。WT和不同突变版本的自动变速箱4-融合到荧光素酶的先导序列显示在每个荧光素酶测量的左侧。(A类)方框表示uORF1和uORF2的WT版本，X表示由于起始密码子突变而导致的无功能uORF。S/S和A/A MEF细胞与自动变速箱4-吕克质粒和对照雷尼利亚萤光素酶质粒。用Tg处理转染细胞6小时（灰色和黑色条）或不使用ER应激剂（白色和斑点条）。相对光单位（RLU）是归一化的萤火虫荧光素单位比率雷尼利亚荧光素酶单位，每个值来自三个独立的转染。为了清晰起见，直方图用两种不同的比例表示。(B)在WT的uORF1和uORF2之间插入了三个具有指示ΔG值（kcal/mol）的茎环结构自动变速箱4-吕克构造。或者，将茎-环结构插入自动变速箱4-包含uORF1突变的先导区域(C类)或uORF2突变(D类). (E类)120-bp序列插入自动变速箱4-uORF1和uORF2之间的引线区域。将转染的S/S MEF细胞用Tg处理6 h（灰色条）或不使用ER应激剂（白色条），并按照以下描述测量RLUA类.
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