Silencing of human polycomb target genes is associated with methylation of histone H3 Lys 27

doi:10.1101/gad.1200204

.2004年7月1日；18(13):1592-605.

doi:10.1101/gad.1200204。

人类多梳靶基因沉默与组蛋白H3 Lys 27甲基化相关

安东尼斯·基米西斯¹, 斯蒂芬妮·巴特利, 安德烈·库兹米切夫, 拉斐尔·玛格伦, 丹尼·赖恩伯格, 罗兰德·格林, 佩吉·法恩哈姆

附属机构

PMID： 15231737
预防性维修识别码：项目经理443521
DOI（操作界面）： 10.1101/gad.1200204

人类多梳靶基因沉默与组蛋白H3 Lys 27甲基化相关

安东尼斯·基米西斯等人。基因开发. 2004.

.2004年7月1日；18(13):1592-605.

doi:10.1101/gad.1200204。

作者

安东尼斯·基米西斯¹, 斯蒂芬妮·巴特利, 安德烈·库兹米切夫, 拉斐尔·马盖隆, 丹尼·雷因伯格, 罗兰德·格林, 佩吉·法恩哈姆

附属

¹美国威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学医学院麦卡德尔癌症研究实验室，邮编53706。

PMID： 15231737
预防性维修识别码：项目经理443521
DOI（操作界面）： 10.1101/gad.1200204

摘要

多梳群（PcG）复合物2和3参与转录沉默。这些复合物含有组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HKMT）活性，可在体外靶向组蛋白H1或H3上的不同赖氨酸残基。然而，尚不清楚这些组蛋白是否是体内甲基化靶点，因为由于缺乏已知的靶基因，尚未在天然启动子的背景下研究人类PRC2/3复合物。在这里，我们报告了使用RNA表达阵列和CpG岛DNA阵列来识别和表征人类PRC2/3靶基因。利用寡核苷酸阵列，我们首先确定了一组基因，这些基因的表达在siRNA介导的从结肠癌细胞中去除Suz12（PRC2/3的核心成分）后发生变化。为了确定哪些假定的靶基因直接与Suz12结合，并精确定位Suz12与这些启动子的结合，我们将高分辨率染色质免疫沉淀（ChIP）分析与定制的寡核苷酸启动子阵列相结合。接下来，我们通过使用ChIP耦合到CpG-岛微阵列来确定其他假定的Suz12靶基因。我们发现，PRC2/3复合物的另外两个组分HKMT-Ezh2和Eed与Suz12共定位到目标启动子。重要的是，Suz12、Ezh2和Eed对靶启动子的招募与Lys 27上组蛋白H3的甲基化一致。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
人类结肠肿瘤中Suz12蛋白表达升高。(A类)Western blot分析证明Suz12抗体的特异性。用HA-Suz12或对照（HA-empty）构建物转染SW480细胞，并进行免疫印迹分析。制备两个单独的印迹，并用HA抗体探测(左边或Suz12抗体(*正确的*面板）。HA抗体只识别HA-Suz12蛋白，而Suz12抗体同时检测HA-Suze2和内源性Suz12蛋白。(B类)对五名不同结肠癌患者的正常（N）和肿瘤（T）组织制备的全组织提取物进行Western blot分析。首先用抗Suz12抗体对印迹进行检测，然后用抗凝集素抗体对其进行复制，作为负载控制。箭头指向正确尺寸为Suz12（93 kDa）的带。第二个较低的谱带，用Suz12抗体在患者1-3中检测到，可能代表蛋白质降解产物。

**图2。**
RNA干扰干扰了结肠癌细胞中Suz12的表达。(A类)用Suz12或GFP siRNA双链体转染SW480细胞后不同时间点提取的总RNA进行RT-PCR分析。在RT-PCR中使用GAPDH mRNA特异性引物，以确保RNA正确定量。(B类)对转染Suz12或Lamin A/C siRNA双链体后不同时间点从SW480细胞制备的全细胞提取物进行Western blot分析。使用针对Suz12和Lamin A/C的抗体显示各自蛋白质的特异性缺失。用肌动蛋白抗体对印迹进行检测，以证明蛋白质样品的载量相等。

**图3。**
从SW480细胞中去除Suz12会导致基因表达的改变。(A类)示意图显示了四个Affymetrix U133A阵列之间的比较，这四个阵列用于分析使用Suz12或GFP siRNAs培养的细胞中的基因表达。箭头上的数字对应于中的列B类第1、2、3和4列表示siSuz12与siGFP的比较，因此可以识别上调和下调基因。第5列和第6列是相同样本的比较；这些应该没有显示任何变化，并用于识别假阳性。(B类)树视图图描述了Suz12缺失后显著解除管制的基因。相对于GFP RNAi样本，红色代表Suz12 RNAi样品中上调的基因，绿色代表下调的基因。配色方案上的数字表示基因表达的倍数变化。用星号表示的基因(^*)在微阵列上被多次识别。(C类)独立RNAi实验的RT-PCR分析证实了使用微阵列获得的结果。RT-PCR中使用GAPDH mRNA特异性引物，以确保RNA得到正确定量。

**图4。**
这个*第一个多年电价*启动子由Suz12直接调控。使用RNA聚合酶II（lane）抗体在SW480细胞中进行染色质免疫沉淀实验2)，Suz12（车道三)和控制IgG（车道4). 还使用Suz12抗体进行了对照免疫沉淀，该抗体与Suz12免疫原预先孵育，以10倍的重量（lane1). 还显示了总输入的三种稀释（车道5——7). 沉淀的染色质用PCR方法分析，所用引物针对所示基因的启动子。

**图7。**
Suz12靶启动子与其他PRC2/3组分结合，并在组蛋白H3的Lys 27处甲基化。(A类)远端示意图*第一个多年电价*显示了启动子位点；正数和负数表示启动子中相对于箭头所示转录起始位点的位置。线条*在下面*这个*第一个多年电价*该位点代表不同PCR引物对扩增的启动子片段。(B类)使用Suz12、Eed、Ezh2、三甲基H3-K27、三甲基H3-K9、组蛋白H3和RNA聚合酶II的抗体在SW480细胞中进行ChIP实验。根据材料和方法中的描述，使用每个ChIP样品的免疫沉淀染色质通过LM-PCR制备扩增物。然后用PCR对扩增产物进行分析。每条车道的数量对应于A类用输入染色质制备的扩增子作为阳性对照。(C类)所示为ChIP实验中DNA大小的示例(左边面板）和从典型LM–PCR反应制备的扩增子(*正确的*面板）。(D类)使用与SW480细胞相同的抗体进行的ChIP实验B类非特异性IgG抗体（lane6)作为阴性对照，输入染色质的三种稀释液（lanes7——9)用作阳性对照以证明线性扩增。使用所示基因启动子的特异性引物，通过PCR分析免疫沉淀染色质。

**图5。**
Suz12绑定到其目标启动子的映射。制备了包含探针的寡核苷酸微阵列，探针代表来自已识别的Suz12-调节基因（图3B）的每个启动子的5-kb区域。使用Suz12抗体、非特异性IgG抗体和输入控制将阵列与ChIP实验制备的扩增子杂交。显示了六个启动子区域：三个上调(*MYT1、EIF3S10、PLCB4*)从细胞中去除Suz12和三个下调的(*SYBL1、RBMS1、RetSDR*)从电池中取出Suz12。通过将Suz12或IgG杂交强度信号除以每个寡核苷酸探针的输入控制信号来计算倍数富集。每个图中的插入显示了使用PCR分析的独立ChIP确认。PCR分析中使用的引物被设计成跨越每个启动子富集峰值最高的区域。Suz12-bound启动子的完整列表和结合位置如表1所示。

**图6。**
额外直接Suz12靶基因的鉴定。(A类)散点图显示CpG岛微阵列上斑点的强度。在SW480细胞中进行了两个独立的实验来鉴定Suz12-bound基因座。红色是与Suz12和输入放大器杂交的代表性阵列的光斑强度。以绿色显示的是与IgG和输入放大器杂交的代表性阵列的光斑强度。选择富集至少三倍的红点进行进一步分析。蓝色斑点在Suz12和IgG对照免疫沉淀中富集至少三倍，代表在ChIP程序中非特定沉淀的DNA片段。(B类)Suz12与每个启动子的5-kb区域结合的确认和映射A类使用定制的寡核苷酸启动子阵列进行。阵列的制备和杂交如图5所示。图中显示了Suz12的折叠丰富性以及六个发起人的输入比较：四个真正的积极目标和两个(*TLK2型*和*PVALB公司*)假阳性。(C类)确认中显示的结果B类采用PCR分析。使用RNA聚合酶II（lane）抗体在SW480细胞中进行独立的ChIP实验1)，Suz12（车道2)和对照IgG（泳道三). 还显示了输入染色质的三种稀释液（车道4——6). 沉淀的染色质用PCR方法分析，所用引物针对所示基因的启动子。

**图8。**
H3-K27在Suz12靶启动子处的甲基化是由于Suz12介导的甲基转移酶Ezh2的招募。使用Suz12（车道）抗体进行ChIP试验*1,6*)、鄂尔多斯2（车道*2,7*)，三甲基H3-K27（车道*3,8*)和控制IgG（车道*4,9*)用siSuz12智能池或无siRNA（模拟）培养的SW480细胞。对于siRNA转染，将细胞与指示的siRNA孵育72 h，然后重新放置并转染72 h。使用针对指示基因启动子的特异性引物，通过PCR分析免疫沉淀染色质。使用PCR监测来自两个处理的等量DNA，如两个输入信号的相似强度所示（参见泳道6和12).

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