跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2004年6月21日；199(12):1641-50.
doi:10.1084/jem.20040520。

两种IkappaB激酶相关激酶在脂多糖和双链RNA信号转导及病毒感染中的作用

Hiroaki Hemmi先生 1, 竹内修（Osamu Takeuchi）, 佐藤信太郎, 山本正弘, Tsuneyasu Kaisho村, 三条英机, 川井太郎, Katsuaki Hoshino公司, 武田清史, 石佐·阿基拉（Shizuo Akira）
附属公司

两种IkappaB激酶相关激酶在脂多糖和双链RNA信号转导及病毒感染中的作用

Hiroaki Hemmi先生等。 实验医学杂志. .

摘要

病毒感染和脂多糖（LPS）或双链RNA（dsRNA）刺激可诱导干扰素（IFN）调节因子（IRF）-3的磷酸化及其向细胞核的移位，从而导致干扰素β基因的诱导。最近，两种IkappaB激酶（IKK）相关激酶，诱导型Ikappa激酶（IK-i）和TANK-binding激酶1（TBK1）被认为是IRF-3激酶，参与Toll样受体（TLR）信号传导和病毒感染中IFN-β的产生。在这项工作中，我们通过基因靶向研究了这些激酶的生理作用。TBK1缺陷的胚胎成纤维细胞（EFs）对LPS或dsRNA的反应以及病毒感染后，IFN-β和IFN-诱导基因的诱导显著减少。然而，在TBK1缺陷细胞中残留检测到dsRNA诱导的这些基因表达，在IKK-i缺陷细胞中完整，但在IKK-i/TBK1双重缺陷细胞中完全消失。在TBK1缺陷细胞中，IRF-3的激活不仅对dsRNA反应，也对病毒感染反应，受到损害。总之，这些结果表明，TBK1以及IKK-i在TLR刺激和病毒感染EF中诱导IFN-β和IFN-诱导基因的过程中起着关键作用，尽管程度较低。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
IKK的生成-我 −/−和TBK1−/−老鼠。（A） 的结构IKK-i公司显示了基因、靶向载体和预测的突变等位基因。封闭框表示编码外显子。S、 SphI公司。（B） 杂合子杂交后代的Southern blot分析。从小鼠尾部提取基因组DNA，用SphI消化，电泳，并与A中所示的放射性标记探针杂交。Southern blotting给出野生型（+/+）的单个19-kbp带，纯合子突变体（−/−）的4-kbp带以及杂合子小鼠（+/-）的两个带。（C） 巯基乙酸合法腹膜细胞的Northern印迹分析。野生型和IKK的硫乙醇酸合法腹膜细胞-我 −/−在指定的时间段内，用100 ng/ml LPS刺激小鼠。将总RNA（10μg）进行电泳，转移到尼龙膜上，并使用IKK进行杂交-我全日空航空公司2-末端片段，IKK的缺失区域-我靶向结构中的基因、TBK1或β-actin cDNA片段作为探针。（D） 干扰素-β启动子报告分析。用指示的表达载体和IFN-β荧光素酶报告载体（0.1μg）瞬时共转染HEK293细胞。转染后36h，检测全细胞裂解液中荧光素酶的活性。（E） 显示了TBK1基因的结构、靶向载体和预测的突变等位基因。封闭框表示编码外显子。B、 巴米。（F） 杂合杂交胚胎EFs的Southern blot分析。从EFs中提取基因组DNA，用BamHI消化，电泳，并与E.Southern印迹中指示的放射性标记探针杂交。野生型（+/+）有一个3.5-kbp的条带，纯合突变体（−/−）有一个1.2-kbp的条带，杂合小鼠有两个条带（+/-）。（G） EFs的Northern blot分析。从野生型和TBK1中提取总RNA−/−EFs用1.0μg/ml LPS刺激指定时间后，电泳，转移到尼龙膜上，并使用IKK杂交-我TBK1或β-actin cDNA片段作为探针。
图2。
图2。
LPS刺激的TBK1中IFN-β和IFN-诱导基因的诱导受损−/−，但不是IKK-我 −/−EFs公司。（A） EFs产生IL-6。控制（IKK-我 +/−或TBK1+/+)、IKK-我 −/−（顶部），或TBK1−/−（底部）用10 ng/ml TNF-α、10 ng/ml IL-1β和100 ng/ml Pam刺激EFs三CSK公司4或1.0或10μg/ml LPS持续24 h。用ELISA测定培养上清中IL-6的浓度。数据显示为三个独立实验中一个代表性实验的三份样品的平均值±SD。（B） LPS刺激EFs中的基因诱导。控制（IKK-我 +/+或TBK1+/−)、IKK-我 −/−（左）或TBK1−/−（右）用1.0μg/ml LPS刺激EFs，持续指定时间。提取总RNA并对指示基因进行Northern blot分析。（C） LPS刺激EFs的微阵列分析。野生型和TBK1−/−用1.0μg/ml LPS刺激EFs，并在指定的时间点收集RNA，用于进行微阵列分析。使用Genespring软件显示绝对表达。信号绝对强度的色码显示在左侧。
图2。
图2。
LPS刺激的TBK1中IFN-β和IFN-诱导基因的诱导受损−/−，但不是IKK-我 −/−EFs公司。（A） EFs产生IL-6。对照（IKK-我 +/−或TBK1+/+)、IKK-我 −/−（顶部）或TBK1−/−（底部）用10 ng/ml TNF-α、10 ng/ml IL-1β和100 ng/ml Pam刺激EFs三CSK公司4或1.0或10μg/ml LPS持续24 h。用ELISA测定培养上清中IL-6的浓度。数据显示为三个独立实验中一个代表性实验的三份样品的平均值±SD。（B） LPS刺激EFs中的基因诱导。控制（IKK-我 +/+或TBK1+/−)、IKK-我 −/−（左）或TBK1−/−（右）用1.0μg/ml LPS刺激EFs，持续指定时间。提取总RNA并对指示基因进行Northern blot分析。（C） LPS刺激EFs的微阵列分析。野生型和TBK1−/−用1.0μg/ml LPS刺激EFs，在指定的时间点收集RNA并用于进行微阵列分析。使用Genespring软件显示绝对表达。信号绝对强度的色码显示在左侧。
图3。
图3。
TBK1在LPS诱导的ISRE结合和IFN-β启动子激活中的需求。（A） TBK1中的ISRE-binding受损−/−EFs公司。控制（IKK-我 +/+或TBK1+/−)、IKK-我 −/−或TBK1−/−用1.0μg/ml LPS刺激EFs达指定时间，并通过EMSA测定ISRE结合（左）和NF-κB结合活性（右）。（B） LPS刺激EFs中MAP激酶的激活。控制（IKK-我 +/−或TBK1+/−)、IKK-我 −/−或TBK1−/−用10μg/ml LPS刺激EFs达到指定时间。制备全细胞裂解物，并用抗磷酸-JNK1/2抗体（phospho-JNK1/2）或抗磷酸-ERK1/2抗体（physpho-ERK1/2）进行印迹。还测定了JNK1/2和ERK1/2的总量。给出了一个具有代表性的实验。（C） TBK1的表达恢复了TBK1中IFN-β启动子的激活−/−EFs公司。TBK1型+/+（WT）或TBK1−/−EFs与人TBK1（hTBK1）和IFN-β启动子荧光素酶报告子共转染。转染后24 h，用或不用10μg/ml LPS刺激细胞12 h，然后测量荧光素酶活性。从两个独立的实验中获得了类似的结果。
图4。
图4。
多（I:C）刺激TBK1中IFN-β和IFN-诱导基因的诱导受损−/−，但不是IKK-我 −/−EFs公司。（A） 聚（I:C）刺激EFs中的mRNA诱导。野生型，TLR3−/−、IKK-我 −/−，或TBK1−/−用10μg/ml poly（I:C）转染EFs达指定时间。分离总RNA并对指示基因进行Northern blot分析。（B） 聚（I:C）刺激后IRF-3二聚体的形成。控制（IKK-我 +/−或TBK1+/+)、IKK-我 −/−或TBK1−/−用10μg/ml poly（I:C）转染EFs，并培养指定时间。制备全细胞提取物并进行天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。Western blotting检测单体和二聚体IRF-3。（C） NF-κB DNA结合活性。野生型，IKK-我 −/−，或TBK1−/−用10μg/ml poly（I:C）刺激EFs达到指定的时间，用EMSA测定NF-κB结合。（D） 聚（I:C）刺激EF中MAP激酶的激活。控制（IKK-我 +/−或TBK1+/+)、IKK-我 −/−或TBK1−/−用10μg/ml poly（I:C）刺激EF达指定时间。制备全细胞裂解物，并用抗磷酸JNK1/2（phospho-JNK1/2）或抗磷酸ERK1/2 Ab（phosphal-ERK1/2）进行印迹。还测定了JNK1/2和ERK1/2的总量。显示了两个独立实验中的一个代表性实验。
图5。
图5。
TBK1对病毒感染EFs中IFN诱导基因表达的要求。（A） 控制（IKK-我 +/−或TBK1+/−)、IKK-我 −/−或TBK1−/−EFs感染重组VSV或SeV达指定时间。提取总RNA并用探针对指示基因进行Northern blot分析。从三个独立的实验中获得了类似的结果。（B） VSV感染反应中IRF-3和NF-κB p65的核转位。将EFs感染重组VSV指定的时间段，提取核蛋白，用SDS-PAGE分离，并用抗IRF-3和NF-κB p65 Abs进行印迹。
图6。
图6。
IKK的参与-我在poly（I:C）信号传导中IFN-β基因表达。（A） 聚（I:C）刺激的IKK的mRNA诱导受损-我 −/−TBK1型−/−细胞。不朽的控制和IKK-我 −/−TBK1型−/−用10μg/ml poly（I:C）转染EFs并培养指定时间。分离总RNA并对指示基因进行Northern blot分析。两个永生EF也得到了类似的结果。（B） IRF-3二聚体的形成。永久控制（IKK-我 +/−TBK1型+/−)和IKK-我 −/−TBK1型−/−用10μg/ml poly（I:C）转染EFs，并培养指定时间。制备全细胞提取物并进行天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过Western blotting检测IRF-3单体和二聚体蛋白。从两个独立建立的永生EF获得了类似的结果。（C） NF-κB DNA结合活性。不朽的IKK-我 +/−TBK1型+/−和IKK-我 −/−TBK1型−/−用10μg/ml poly（I:C）转染EFs达指定的时间段，并通过EMSA测定NF-κB结合。从两个永生EFs系获得了类似的结果，非特异性条带。（D） MAP激酶激活。不朽的IKK-我 +/−TBK1型+/−和IKK-我 −/−TBK1型−/−用10μg/ml poly（I:C）刺激EF达到指定时间。制备全细胞裂解物，并用抗磷酸-JNK1/2抗体（phospho-JNK1/2）或抗磷酸-ERK1/2抗体（physpho-ERK1/2）进行印迹。还测定了JNK1/2和ERK1/2的总量。给出了两个独立实验中的一个代表性实验。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Janeway，C.A.，Jr.和R.Medzhitov。2002.先天免疫识别。每年。免疫学评论。20:197–216. 2001年10月4日首次出版；10.1146/anurev.immuniol公司。20.083001.084359.-公共医学
    1. 武田、K.、T.凯绍和S.阿基拉。2003.类Toll受体。每年。免疫学版。21:335–376. 2002年12月19日首次出版；10.1146/annurev.immunol.21.120601。141126-公共医学
    1. Takeuchi，O.、S.Sato、T.Horiuchi、K.Hoshino、K.Takeda、Z.Dong、R.L.Modlin和S.Akira。2002年，Toll样受体1在介导微生物脂蛋白免疫反应中的作用。免疫学杂志。169:10–14.-公共医学
    1. Takeuchi，O.、T.Kawai、P.F.Muhlradt、M.Morr、J.D.Radolf、A.Zychlinsky、K.Takeda和S.Akira。2001.Toll样受体6对细菌脂蛋白的鉴别。国际免疫学。13:933–940.-公共医学
    1. Takeuchi，O.、K.Hoshino、T.Kawai、H.Sanjo、H.Takada、T.Ogawa、K.Takeda和S.Akira。1999。TLR2和TLR4在识别革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞壁成分中的不同作用。免疫。11:443–451.-公共医学

出版物类型

MeSH术语